用定量蛋白质组学方法鉴定蛋白S-亚硝基化靶点

Moran Benhar1, J. Will Thompson2, M. Arthur Moseley2, and Jonathan S. Stamler3

1 生物化学系，拉帕波特医学科学研究所，教授，医学院，以色列理工技术学院，海法，以色列

2北卡罗来纳州基因组科学与政策研究所，杜克大学，达勒姆，美国

3凯斯西储大学医学院和克利夫兰大学医学院分子医学研究所，

克利夫兰，俄亥俄州，美国

摘要：可逆蛋白半胱氨酸亚硝基化（S-亚硝基化）是用于信号转导等多种细胞过程的一个共同机制。蛋白质脱亚硝基化很大程度上是由半胱氨酸脱亚硝基化酶介导的，但这些酶的功能范围和意义还未完全确定，部分原因在于同源底物的信息有限。本文用Jurkat（人白血病细胞系）细胞培养（SILAC）中采用稳定同位素标记氨基酸，联合生物素转化技术和质谱分析技术，以识别46个新的脱亚硝基化酶底物，硫氧还蛋白1。这些底物参与多种细胞功能，包括细胞骨架组织、细胞代谢、细胞信号转导和氧化还原内稳态。本文还发现，多数S-亚硝基化蛋白不是硫氧还蛋白1的底物。本文的研究主要是基于RAW264.7cells。研究结果表明：在采用定量蛋白组学高通量地测定脱亚硝基化底物中，硫氧还蛋白1是哺乳动物细胞中的主要脱亚硝基化蛋白酶。

S-亚硝基化的重要性在很多研究中都证实了其重要性，亚硝基半胱氨酸（Cys）巯基共价结合有调节多种蛋白的功能，从而影响细胞和有机体过程，包括转录、代谢、呼吸作用、细胞生长和存活。除了其在生理反应的作用，当亚硝基化—脱亚硝基化的平衡被打破时，蛋白发生异常的巯基亚硝基化，从而引起一系列的人类疾病，包括肌肉、心肺疾病、神经退行性疾病和癌症。因此，调节蛋白质巯基亚硝基化和脱亚硝基化机制的研究非常重要。

任何细胞蛋白质巯基亚硝基化取决于亚硝基化和脱亚硝基化之间的平衡水平。而以往的研究主要集中在NO的加入，分析脱亚硝基化滞后。了解如何用信号转导调节蛋白质巯基亚硝基化和细胞如何处理硝化应激对阐明蛋白质脱亚硝基化机制是非常重要的。最近的研究提供了关于蛋白质脱亚硝基化细胞机制的新的见解，即通过Cys脱亚硝基化酶介导的脱亚硝基化。其中，特别是两个酶系统，谷胱甘肽/S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSH/GSNOR）系统和硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶（Trx/TrxR）系统建立的有关脱亚硝基化酶的生理系统。虽然它们的作用机制不同，GSH/GSNOR和Trx/TrxR都在保护微生物、植物和哺乳动物细胞的亚硝化应激，调节多种NO相关的细胞和系统应答中起作用。

硫氧还蛋白（Trxs）是在活细胞的许多过程中发挥着重要作用的普遍存在的蛋白，并且被认为是细胞氧化应激反应的关键因素。Trxs有一个保守的Cys-Gly-Pro-Cys氧化还原活性位点，是它们作为氧化还原必不可少的。最近的研究发现Trxs在细胞信号和保护上的一个新的角色，是通过脱亚硝基化介导肽和蛋白质。Trxs的脱亚硝基化酶活性耦合关联同源蛋白还原酶（TrxR），黄素含硒酶。例如，细胞内Trx1/TrxR1底物caspase-3和caspase-8的S-亚硝基硫醇（SNO），而线粒体相关的基因Caspase-3通过Trx2/TrxR发生脱亚硝基化来调节死亡受体信号转导。此外，微生物和哺乳动物的Trx系统已显示出对亚硝化应激的保护，这是由蛋白质巯基亚硝基化危险水平介导的。与Trx的这个角色一致，NO已被证明能诱发脱亚硝基化酶的活性，至少部分通过Trx抑制剂抑制，Txnip。越来越多的证据表明，硫氧还蛋白的价值其脱亚硝基化酶功能，是NO/SNO—依赖性反应的重要调节器。

最近有报道提出，实际上Trx使多种蛋白（SNO蛋白）发生脱亚硝基化。虽然有少数的内源性SNO-底物（除Caspase-3外）的Trxs基因已被确定，但这只是冰山一角。Trx SNO—底物的完整识别是为了定义受Trx/TrxR以及脱亚硝基化蛋白特异性分子组成的NO—相关的细胞过程。作为解决这些问题的第一步，我们设计了一种蛋白质组学方法来鉴定大量新型Trx SNO—底物，在选定的情况下当场得到验证。结果显示，蛋白质脱亚硝基化蛋白底物和细胞过程的大量识别有一个原理证明，这可能受NO和Trx协调调节。

实验程序

材料

S-亚硝基-半胱氨酸（CysNO）由L-半胱氨酸采用酸化亚硝酸盐合成。抗体如下：14-3-3theta;来自自圣克鲁斯生物技术公司；peroxiredoxin-1来自Upstate Biotechnology；annexin-1来自 BD生物科学实验室。重组大鼠TrxR1来自美国Diagnostica公司。重组人Trx1在大肠杆菌中产生，通过镍亲和层析纯化。金诺芬购自BioMol。生物素-HPDP和链霉亲和素琼脂糖均购自Pierce。gamma;-干扰素购自Ramp;D 系统公司。L-13C615N4-精氨酸和L-13C615N2-赖氨酸购自Sigma。改进的RPMI-1640培养基，透析过得胎牛血清和所有其他试剂均购自Sigma。

细胞培养

Jurkat细胞 (人白血病细胞系)培养于含10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的RPMI-1640 培养基中。于 37°C ，5% CO2条件下培养。RAW264.7细胞培养于含10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的DMEM培养基中。于 37°C ，5% CO2条件下培养.通过与相应的重同位素标记的氨基酸在细胞取代正常精氨酸和赖氨酸制备技术中。SILAC培养基用相应的重同位素标记的氨基酸取代正常的精氨酸和赖氨酸。SILAC培养基 含10%透析过得胎牛血清和抗生素。为了生成两个标签，一个群体的细胞在含L-12C6 14N4精氨酸(Arg0)和L-12C614N2-赖氨酸（lys0）“轻”的SILAC培养基中，而其他种群生长在含L-13C615N4精氨酸(Arg10)和L-13C615N2-赖氨酸 (lys8)的“重”的SILAC培养基中。所有的培养基均在同一时间准备，被标记的细胞在进行实验前将被培养6代。

脱亚硝基化法

Jurkat细胞均匀地分布在低渗缓冲液（10 mM Hepes, 3 mM MgCl_2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5) ，然后100,000g，4°C离心1hr。用Bradford法测得上清液中含有mg/ml蛋白胞浆用vehicle或CysNO (终浓度50 mu;M) 室温暗处理30min。这一步骤后，低分子量的物质（包括残余的CysNO）被反复循环通过一个10 kDa的截止滤光片（Amicon Ultra-15,微孔）过滤并用HENE buffer (25 mM Hepes, 1 mM EDTA, 10 mu;M neocuproine, pH 7.5)洗涤。样品在总体积为0.5ml的体系中用GSH或重组Trx系统（5mu;M TRX，100 nm，200mu;m TrxR，NADPH）中孵育培养以发生脱亚硝基化。为了减少SNO自发分解，反应避光且加入金属螯合剂EDTA。其中，蛋白质-SNOs来自低分子量的SNO如下所示：一半的样本被转移到一个单独的微量离心管。加入三倍体积的冰丙酮后，样品在20°C孵育30 min，然后5000times;g，4°C，离心5 min。用HEN buffer重悬蛋白，冰浴保存至分析。另一半的样本被转移到一个10 kDa的截止滤光片（离心超滤管，YM-10，离心过滤器，微孔）。离心后，滤液中含有低分子量的物质被存储在冰上，直到分析。通过还原化学发光测定锡含量。

用生物素转化法技术鉴定巯基亚硝基化的蛋白

内源性的S-亚硝基化蛋白的检测使用生物素转化技术。总之，用lysis buffer (50 mM Hepes, pH 7.5, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA and protease inhibitor cocktail (Roche))制备全细胞裂解液。用等体积blocking buffer(含0.2% S-甲基甲烷硫代磺酸和20% SDS的HEN buffer)处理全细胞裂解液。样品在50℃条件下孵育20min，并不断涡流。然后用3倍体积的丙酮在-20℃的条件下沉淀1h。离心后，蛋白质颗粒用冰丙酮洗涤去除残余甲基甲烷硫代磺酸。颗粒用HENS buffer(含1%SDS)重悬，再加入新鲜制备的生物素biotin-HPDP和抗坏血酸钠，终浓度分别为0.4 mM和20 mM。孵育2h后，样品用链霉亲和素对样品进行纯化，接着进行western blot或MS分析。

蛋白质组学分析的样品制备

之前的亚硝基化蛋白用悬浮法从链霉亲和素树脂中提取出来。加入3倍体积含0.3%三氟乙酸（Pierce）在70/30v/v水/乙腈（Fisher Scientific）振动30 min，含蛋白的树脂变成颗粒且浮在上清液，在高速真空中干燥。蛋白重悬在20ul含0.1%RapiGest SF（Waters）50mM碳酸氢铵（VWR）的溶液中轻度加热。肽用1%w/w的测序分级改性胰蛋白酶（Promega）在37℃下消化过夜消化。RapiGest用三氟乙酸（TFA）和乙腈水解到1%和2%v/v水解，加热（60℃）2h。肽混合物冷却至室温，根据制造商的要求用C18Zip Tips(Millipore)清洗。肽进行干燥，悬浮在20ul0.1%v/vTFA 和2% v/v乙腈。每个样品重复进行LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析

5ul的样品被注入到一个75mu;m times; 250 mm的BEH C18柱（Waters），用5%到40%梯度的乙腈和0.1%甲酸分离，用0.3 mL/min的流量，在nanoacquity液相色谱仪（Waters）中分离90min。液相色谱柱的出口连接到LTQ-Orbitrap杂交质谱仪（Thermo）。Orbitrap质谱方法使用CID碎片，结果也由Orbitrap产生。简而言之，前驱体扫描方法配置模式和60000分辨率，1e6de AGC目标设置为和1微扫描。用前3的前体离子高于1000阈值计数进行MS/MS采集，使用过碰撞诱导解离（CID）以35％的3Da隔离窗口，标准化碰撞能量，以及1微扫描。产品离子光谱收集在情景模式下7500的分辨率，2e5的AGC目标设定。动态排除设置为重复计数为3，重复时间=30秒，排除列表=250，排斥时间为120s。

多肽鉴定与定量

用Rosetta Elucidator V3.2（Rosetta序列）和Mascot v2.2 (Matrix Sciences)完成SILAC定量鉴定多肽。Mascot搜索与SwissProt数据库v57.1不同，用人类的分类(http://www.uniprot.org/)，由Elucidator直接完成。数据库搜索参数为10 ppm前体和0.02Da产物离子耐受性，以氧化（M）、甲硫基（C），标签：13C615N2 (K)和标签：13C615N4 (R)为变量的修改。如果他们通过0.8 peptideteller置信度阈值则肽鉴定可被接受；用诱捕数据库搜索确定肽FDR为小于1%。标记（SILAC）对位于阐释者与最低的15 ppm和保留时间为0.2min耐受m/z公差，和最多3个标记的氨基酸肽。SILAC比率的计算没有用强力归一化，用的是同位素丰度最高的峰高。

结果

为了评估硫氧还蛋白介导的巯基亚硝基化修饰，我们建立了一个体外系统，在能控制良好的条件下发生脱亚硝基化。我们用Jurkat细胞制备了胞浆部分使其在离体情况下发生巯基亚硝基化用暴露的亚硝基代替巯基亚硝基半胱氨酸(CysNO，50mu;M，30 min, 见实验程序)CysNO作用导致明显的蛋白S-亚硝基化（每毫克蛋白质2纳摩尔总SNO），通过还原性化学发光测定（还评估了生物素转化法，如下）。在37℃的条件下，亚硝基化裂解长达一个小时的孵化伴随着缓慢的脱亚硝基化，很明显，SNO含量小且逐步减少（图1A）。当一个Trx系统—由Trx，TrxR和NADPH组成—加入裂解液，该脱亚硝基化率显著提高。例如，Trx系统孵育30 min后，SNO含量下降46%相比在vehicle-treated裂解液中12%的减少。在60分钟时，脱亚硝基化接近平稳，剩余30%的SNO，SNO的子集发生脱亚硝基化在Trx中反应为失败。这些数据以及其他细胞获得的类似数据表明，Trx可以催化多种蛋白质脱亚硝基化。

本文采用同样的方法来评估GSH依赖的脱亚硝基化。用GSH孵育样品使其亚硝基化，结果总的SNO含量略有下降。10分钟的曝光处理，1毫摩和5毫摩的GSH，SNO总含量分别有5%和15%的减少。GSH与巯基亚硝基蛋白质反应的主要产物是GSNO；因此总SNO分析不能揭示SNO的命运。根据反应产物的分离分子量（MW）显示，高分子量SNO

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