亚硝化应激对细胞凋亡的调控

Ki-Mo Kim, Peter K.M. Kim, Young-Guen Kwon, Se-Kyung Bai,Woo-Dong Nam and Young-Myeong Kim

血管系统研究中心，江原大学，春川，江原道，韩国

外科，医学，匹兹堡大学，匹兹堡，PA15213

食品与营养，自然科学部，翰林大学，春川，江原道，韩国

骨科分子和医学的细胞生物化学学院，春川，江原道，韩国

摘要：亚硝化应激可预防或诱导细胞凋亡。通过一氧化氮（NO）与蛋白质的生物硫醇的S-亚硝基化发挥作用。细胞的氧化还原电位和非血红素铁含量决定着S-亚硝基化水平。细胞凋亡可被caspase家族蛋白酶的催化位点的氧化还原敏感的巯基的亚硝基化抑制，这在细胞凋亡信号级联中起着重要作用。亚硝化应激也可以通过线粒体凋亡途径，如细胞色素C，细胞凋亡诱导因子，和核酸内切酶的G从线粒体的释放，以及NF-kappa;B活性的抑制的活化促进细胞凋亡。本文综述了S-亚硝基化及其硝化应激在细胞凋亡信号通路中的调节机制。

关键词：NO、细胞凋亡，亚硝化应激，S-亚硝基化，线粒体

NO合成及其作用方式

一氧化氮（NO）是一种短暂的，扩散的自由基，由L-精氨酸反应产生。它可由三种NO合成酶（NOS）亚型催化产生，催化-内皮型NOS（eNOS）、神经元型NOS（nNOS）和诱导型NO合酶（iNOS）(Ignarro et al., 1987; Nathan, 1992)。NO的功能作用可因为细胞类型和酶的不同而发挥不同的功能。eNOS的主要功能是调节血管张力。nNOS主要作用包括逆行穿过突触信号。主要的iNOS可大大上调激活通过免疫细胞和许多其他组织的细菌细胞壁成分脂多糖（LPS）和/或细胞因子。在正常的细胞内钙水平，由iNOS产生的NO量受到酶，底物，或共同存在因素的限制(Xie and Nathan, 1994; Gross and Wolin, 1995)。与此相反， eNOS和nNOS的是组成型表达，并在正常的钙离子浓度范围没有活性，而在细胞内钙水平短暂增加时生产皮尔摩量的NO。然而，慢性钙升高会导致NO的持续产生(Ignarro et al., 1987; Nathan, 1992)。在可产生NO的细胞扩散出NO前，NO可直接与几个细胞靶分子相互作用。由于NO是相对小的和疏水性的，它可以很容易地通过膜。NO在体内只能存活几秒钟，它可以扩散几个细胞直径从其合成场所合成(Lancaster, 1994)。当共培养红细胞清除生物NO时，在产生NO的肝细胞中，亚硝基酰基铁配合物的形成显著地抑制细胞内NO反应产物的产生(Nussler et al., 1993)。这表明，NO的细胞扩散比细胞内的反应与目标分子的细胞内NO生成速度更迅速。因此，由一个细胞所经历形成的稳定的NO浓度是由它附近所能产生NO的细胞数目所决定的(Beckman and Koppenol, 1996)。NO是细胞内产生的，可由相互作用的生物分子通过自分泌和旁分泌的方式产生。

NO的生化反应

在水性缓冲液中，NO通过与氧的反应而衰变为亚硝酸盐，其衰变率很大程度上取决于NO的浓度(Kerwin and Feldman, 1995)。在最大的生物浓度（1-5micro;M），NO体外半衰期为几分钟；它远远长于在正常生理浓度下的半衰期时间(Ignarro et al., 1993; Kim et al., 1995)。然而，其生物半衰期小于5秒(Ignarro et al.,1993)。这表明，在体内，NO通过与氧发生最小反应，或通过与其他生物分子的反应途径衰减(Kim et al., 1995)。简单地说，NO可以与分子氧反应生成亚硝酸盐。可是在生理浓度的氧气范围内，这种反应是非常缓慢的。NO可与O₂迅速反应，形成强氧化剂过氧亚硝基阴离子（ONOO^-minus;），它是一种细胞毒性调制器和杀菌剂(Zhu et al., 1991)。NO也与许多含血红素的蛋白质相互作用。NO与血红蛋白和肌红蛋白的血红素铁反应形成硝酸盐。NO激活鸟苷酸环化酶结合的血红素铁从GTP生成cGMP，在调节血管张力和神经传递中起着关键作用(Gruetter etal., 1980)。抑制NO与血红素铁结合的血红素酶有几种，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和细胞色素P450 (Kim et al., 1995)。NO与几种生物组分（如金属、硫醇、O₂和O^2minus;）反应可生产多种副产品，范围从无害的氧化成分（NO₂和NO^3minus;）到有活性的氮中间体，如氮氧阳离子（NO ），过氧亚硝基阴离子（ONOO^-minus;），亚硝基硫醇（RSNO）、氮氧阴离子（NO^minus;）、三氧化二氮（N₂O₃），二氧化氮（NO₂）(Beckman et al., 1996)。这些活性氮物种，包括NO与生物分子相互作用引起的脂质过氧化，蛋白质修饰（如半胱氨酸和酪氨酸残基），通过碱基修饰的DNA损伤，酶活性的调节。

在亚硝化反应中，亚硝胺和亚硝基硫醇的形成是胺和硫醇基团分别加上氮氧阳离子（NO ）形成的(Gruetter et al.,1980)。啮齿动物巨噬细胞的活化是由iNOS基因表达和存在于培养基中的目标分子的亚硝化中NO的产生干扰素-gamma;和/或LPS的结果(Gruetter et al., 1980; Zhu et al., 1991)。一些iNOS的依赖性反应途径具有在生物系统中的硝化化学潜在相关性。酸化亚硝酸盐（HNO₂）是一种亚硝基化剂，它仅在低PH的环境下容易形成，比如胃(Zhu et al., 1991)。来自巨噬细胞和肝细胞，可由细胞因子和LPS(Kim et al., 1995; Kim et al., 2000)激活的亚硝基酰基铁配合物可以提供用于硝化的机制，特别是反式S-亚硝化(Kim et al., 2000)。化学合成亚硝基酰基铁配合物在体外诱导caspase和白蛋白的S-亚硝基化(Boese et al., 1995; Kim et al., 2000)。三氧化二氮（N₂O₃），是NO与氧分子的胺和硫醇部分在生理PH条件下反应形成具有很强的倾向的亚硝化反应形成的(Kharitonov etal., 1995)。

通过亚硝化应激诱导NO的S-亚硝基化

有资料表明，NO或相关分子可以通过三个化学反应的S-亚硝基，氧化（RS-SR）和ADP-核糖基化共价修饰蛋白质的半胱氨酸残基(Brune and Lapetina 1989; Stamler, 1994)。这些翻译后修饰一般用于细胞应答的调节(Stamler, 1994; Stamler et al., 2001)，尤其是蛋白质和非蛋白巯基在体内和体外发生的以氧化还原为基础的亚硝基化反应(Brune and Lapetina, 1989; Kim et al., 1995)。S-亚硝基通过改变蛋白质功能来调节基因表达和细胞内环境稳定(Stamler, 1994; Kim et al., 1995; Chung et al., 2001)。亚硝化应激的概念已经从理解亚硝基化也可以达到危险的水平。在这种条件下，亚硝基化可能直接抑制关键蛋白质的功能(Stamler, 1994)，降低氧化还原电位(Chung et al., 2001)，和/或促进有害氧化修饰(Marshall et al., 2001)。在细胞水平上，亚硝化应激已与细胞的生长抑制和凋亡有联系，并因此可被广泛牵涉于多种人类疾病的发病机制。特别是caspase的蛋白水解酶，细胞凋亡的关键因子，具有氧化还原敏感的半胱氨酸残基的催化位点。NO可以通过在体外和体内的S-亚硝基化修改此酶，表明生物和化学生成NO可调节细胞凋亡。

Caspase在细胞凋亡信号通路中的关键作用

细胞凋亡，被称为程序性细胞死亡，是多细胞生物的正常发育及维持组织稳态必不可少的(Steller, 1995)。它是活跃的发生细胞皱缩，细胞膜起泡，染色质凝聚和DNA断裂的能量依赖性过程。细胞凋亡是受严格控制的细胞内信号转导事件，通过肿瘤坏死因子受体家族（TNF-R）的特异性死亡受体结扎启动，如肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;），CD95/ Fas水平/ APO-1和受体肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）。配体三聚受体结合募集细胞内接头分子如FADD / MORT1和TRADD到死亡诱导信号复合物（DISC）。然后它调动和激活被称为前caspase-8的蛋白酶酶原(Boldin et al., 1996)。caspase-8的激活是已知的涉及其他caspases激活顺序(Thornberry and Lazebnik, 1998)。caspase是组成型表达为在细胞中的无活性酶原，并成为由蛋白水解加工激活时细胞接受凋亡诱导的信号(Craen et al., 1999)。蛋白水解切割的结果是除去N-末端前结构域和产生的小（P10）和大（P20）的活性亚单元，形成活性的四聚体（P10 / P20）2. Caspase家族的半胱氨酸蛋白酶（包括14个亚型），它们是CED-3的哺乳动物对应物，即所需的程序性细胞死亡中的线虫的蛋白酶(Nicholson et al., 1995)。一些成员（包括caspase-8，-9，和10）包含一个大的前结构域，并且是​​细胞凋亡信号级联的引发剂。其他诸如caspase-3，-6和7，具有一小前结构域和参与细胞凋亡的执行阶段。

线粒体是细胞凋亡信号的中央亚细胞器

由死亡受体介导和其他促凋亡刺激介导的两种凋亡信号传导途径。细胞表面死亡受体的活化（例如TNF-alpha;受体，FAS，和TRAIL受体）募集胱冬酶原8至DISC;caspase8就变成了未激活的。活性caspase-8既可以直接激活下游caspase，例如caspase-3，并裂解细胞色素C-effluxing细胞质因素Bid分为两个片段(Luo et al., 1998; Li etal., 1998)。 C-末端P15片段易位到线粒体，并诱导细胞色素c和核酸内切酶G释放到细胞质(Li et al., 2001)。另一方面，细胞凋亡受体依赖性诱导剂（如生长因子撤出，紫外线照射和化疗药物）会引起线粒体细胞色素C和核酸内切酶G在没有caspase-8活化激活的情况下释放，也可能诱导线粒体膜损伤。可以通过抗凋亡的癌基因，如Bcl-2和Bcl-XL来防止通过用凋亡诱导刺激治疗进行的色素c再分配(Yang et al., 1997)。许多研究表明，细胞内细胞色素C与活化因子-1和胱冬酶原-9在dATP的存在下相互作用形成 “凋亡体”，这会导致caspase-9的激活(Liu et al., 1996)。活性的caspase-9导致下游蛋白酶caspase-3的活化，这被认为是保证所需要的完整的终端事件发现目标蛋白的细胞凋亡。例如，DNA片段化因子（DFF）在人体中的切割(Liu et al., 1997)，或通过caspase-3的半胱天冬酶激活的脱氧核糖核酸酶（ICAD）的鼠类似物抑制剂导致激活的CAD的释放(Enari et al., 1998)， 然后将其转位至细胞核，这导致DNA降解和凋亡性细胞死亡(Sakahira et al., 1998)。然而，最近的研究已经表明，由于受tBid或其它毒性试剂诱导的线粒体膜损伤的结果，核酸内切酶G被释放到胞质溶胶中。然后它易位到细胞核诱导染色体间DNA片段化(Li et al., 2001)。这种酶大部分存在于膜间隙中，只有一小部分参与线粒体基质中DNA的复制。线粒体内切酶G的释放表示由线粒体引发的哺乳动物细胞死亡的非caspase依赖的凋亡途径启动。这将是有趣的，看到在进化树中的核酸内切酶G（不同物种）获得该促凋亡特征。也许，核酸内切酶G负责的非caspase依赖性细胞死亡和DNA片段在植物、真菌和原生动物中已观察到。

亚硝化应激抑制caspase的活性

NO可以诱导一些细胞的凋亡也可以阻止其他细胞的凋亡(Kim et al., 1999)。众所周知，高浓度的NO是具有细胞毒性的，通过抑制线粒体乌头酸酶和线粒体复合物I和II 的产生(Brown, 1999)，p53基因的诱导表达(Brockhaus and Brune, 1999)，和抑制DNA合成限速酶的及核糖核苷酸还原酶来抑制ATP的合成(Kwon etal., 1991)。iNOS诱导巨噬细胞主要是IFN-gamma;/ LPS通过增加的S-亚硝基蛋白质的形成诱导亚硝化应激，这也是NO介导细胞凋亡的一个关键因素(Fisch et al., 2000)。然而，我们及其他资料已在体外和体内证明，NO可保护几种细胞免受细胞毒性刺激（包括肝细胞，神经元PC12细胞和内皮细胞），如TNF-alpha;，Fas，血清剥夺，和氧化应激(Kim etal., 1995; Kim et al., 1997; Kim et al., 1999; Kwon et al.,2001)。低水平的内源性NO的产生或从外源性NO供体产生的NO是以前防止人类B淋巴细胞(Mannick et al., 1994)，卵泡(Chun et al., 1995)，神经元细胞(Kim etal., 1999)、MCF-7乳腺癌

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