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纳米银和银离子对陆生植物拟南芥生长毒性的比较研究

摘要

银纳米粒子（AgNPs）是应用最广泛的纳米材料之一，但AgNP在陆地植物中的毒性机制尚不清楚。我们从生理、超微结构和分子水平比较了AgNPs和Ag 对拟南芥的毒性作用。AgNPs不影响种子萌发;但它们对根伸长的抑制作用强于Ag 。透射电镜和金属含量分析结果表明，AgNPs可在叶片中积累。这些吸收的AgNPs破坏了类囊体膜结构，降低了叶绿素含量，从而抑制了植物的生长。相比之下，银离子处理的幼苗中，少量的Ag离子被幼苗吸收，且不像AgNPs那样明显地影响叶绿体结构和其他金属离子的吸收。与Ag 处理相比，AgNPs可以改变抗氧化和水通道蛋白相关基因的转录，说明AgNPs改变了氧化-抗氧化系统之间的平衡，也影响了植物体内水和其他小分子之间的稳定性。所有从生理、超微结构和分子水平的数据表明，AgNPs的毒性大于Ag 。

背景介绍

纳米粒子（NPs），也称为颗粒纳米材料，被定义为小于100nm的粒子。纳米粒子的小尺寸、结构和表面特征赋予其新的物理和化学性质，而同一材料的块状粒子并不共享这些性质(Stampoulis et al., 2009)。由于其特殊的性质，NPs被用于各种应用，从化妆品到医学等方面。纳米技术相关产品的年价值预计将在2015年达到1万亿美元(Roco, 2005)。NPs的广泛使用将通过大气排放、废水、农业和生产/运输过程中的意外排放造成环境污染(Colvin, 2003)。在过去的几年里，NPs的毒理学已经在许多物种中得到了研究，包括细菌、藻类、无脊椎动物(线虫和甲壳类动物)、鱼类和脊椎动物(大鼠与人类)(Stampoulis et al.， 2009)。NPs可以影响生物体，被细菌、植物、动物和人类细胞吸收(Khodakovskaya et al.，2011)。关于NPs（TiO2、ZnO、Mg、Al、Pd、Cu、Si、C60富勒烯和多壁碳纳米管）在高等植物中的毒性研究表明，NPs对生长有负面影响。例如，氧化铜纳米颗粒通过诱导过量ROS(活性氧物质)的形成，强烈抑制草地植物和蓝藻的生长并诱导其DNA损伤(Wang et al.， 2011;Atha et al.， 2012)。只有少数报告表明对植物生长有积极影响。正如Khodakovskaya et al(2011)报道,50mu;g /毫升的碳纳米管能通过激活许多压力相关基因的转录,比如编码水通道和热休克蛋白的基因，从而增强番茄生物质(新鲜和干植物)。纳米银(AgNPs)是消费品库存中最重要的纳米材料之一，因为它具有已知的抗菌特性，在个人护理产品、食品服务、建筑材料、医疗器械和纺织品中都很有用(Park et al.， 2010)。目前，AgNPs被用于250多种产品中(Fabrega et al.， 2011)。随着使用量的增加，污染水中AgNPs的最高浓度记录为145 mg/L (Kaegi et al.， 2010)。许多报告表明，AgNPs对细菌、鱼类、藻类和其他生物具有高度毒性(Fabrega et al.，2009;Griffitt等，2008;Miao et al.，2009;纳瓦罗等人，2008)。在探讨AgNP毒性机制的同时，Navarro等人（2008年）指出，AgNPs抑制淡水藻类衣藻的光系统II量子产率。其他研究人员注意到，AgNPs通过破坏不同阶段的细胞分裂和破坏根皮层细胞、表皮和根冠来抑制植物生长(Kumari et al.，2009;Stampoulis等人，2009)。然而，由于研究的数量有限，仍然很难完全理解AgNP在陆地植物中的毒性机制。鉴于商业AgNPs产量的增加可能会对生态系统产生潜在的负面影响，我们必须拓宽关于AgNPs毒性的知识，以预测与这些材料相关的环境和人类健康风险。因此，本研究的目的是通过比较AgNPs与Ag 的毒性，阐明AgNPs对拟南芥生长、细胞超微结构和抗氧化系统的毒性作用。

1材料和方法

1.1培养条件

用75%乙醇和1%次氯酸钠(V/V)对哥伦比亚(Col-0)生态型拟南芥种子进行灭菌处理。灭菌后的种子在4℃下春化2天，然后在含有或不含不同浓度AgNPs的Murashige和Skoog琼脂板(含30 g/L蔗糖和0.8%琼脂)上萌发。AgNPs购自上海沪正纳米技术有限公司，根据制造商的数据和我们的透射电镜(TEM)的检测结果，颗粒直径约为10纳米(图S1)。加入培养基后，通过超声振动将AgNPs分散。对于阳性对照，我们使用相同浓度的Ag (来自AgNO3)进行实验，来比较AgNPs和Ag 的毒性。拟南芥在光照强度为300mu;mol/（m2·sec）的12小时光/暗循环下，在（25plusmn;0.5）°C的培养室中生长。每个处理准备三份生物重复，每个重复至少包含10个植株，1周和2周后获得样品进行形态学、生理学和基因表达分析。

1.2植物组织中叶绿素、花青素和金属含量分析

根据Inskeep和Bloom（1985）的方法，采用N，N-二甲基甲酰胺提取拟南芥的叶绿素。利用分光光度计在647和664.5 nm处获得吸光度值，根据Inskeep和Bloom(1985)报道的公式计算叶绿素a (Chl-a)、叶绿素b (Chl-b)和总叶绿素(total - chl)含量。处理组和对照组的叶片（约50毫克）被磨成粉末，在300mu;L的HCl：MeOH（1：99，V/V）中孵育一夜，温度为4°C。随后，加入200mu;L的水和500mu;L的氯仿，并将混合物离心分离叶绿素。上清液可用于测量花青素，如Yoo等人所示（2011）。为了测量拟南芥中的金属含量，收集了对照组和处理组（暴露于2mg/L的AgNPs和Ag中两周）的幼苗，并在硝酸中干燥和消化。随后，用电感耦合等离子体质谱系统（ICP-MS，Agilent7500a，美国）将样品稀释到Milli-Q水中进行分析。

1.3电子显微镜分析

对照组和处理组的样品(暴露于3 mg/L AgNPs和Ag 两周)根据我们之前的报告进行固定和嵌入(Qian et al.， 2008)。在TEM分析之前，将固定的植物组织用超微体(Leica Reichert Ultracut S, Vienna, Austria)切成超薄切片(70-90 nm)，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。然后用JEM-1230显微镜观察超薄切片（JEOL Ltd.，日本东京）。

1.4 RNA提取、逆转录和实时PCR分析

用RNA提取试剂盒（Sangon公司，中国上海）收获了拟南芥幼苗，并在液氮中研磨以提取RNA。在260和280n m处用分光光度法测定RNA的数量和质量。用1%琼脂糖甲醛凝胶电泳检测RNA的完整性。然后使用反向转录酶试剂盒（Toyobo，东京，日本）将高质量的RNA反向转录成cDNA。使用Eppendorf MasterCyclerep RealPlex4（Wesseling-Berzdorf，德国）进行实时PCR，并且PCR protocol是按照我们之前的报告（钱等人，2011年）进行的。以前设计的引物对（钱等人，2011年）被用来扩增22个抗氧化基因，包括3个Cu/ZnSO D基因（CSD1-3）、1个MnSO D基因（MSD1）、3个Fe-SO D基因（FSD1-3）， 一个CAT基因（CAT）、五个抗坏血酸过氧化物酶基因（APX1-5）和八个谷胱甘肽过氧化物酶基因（G PX1-8）。同时选择6个水通道蛋白基因：SIP1；1，SIP1；2，TIP1；1，PIP1；2，PIP2；1，PIP2；2。

1.5数据分析

结果表示为均值（SEM）的平均plusmn;标准误差。使用Studentrsquo;s t test与相应的对照数据进行比较，并使用StatView5.0对数据进行评估。当p小于0.05或0.01时，有统计学显着性差异。

2结果

2.1 AgNPs和Ag对种子萌发和幼苗生长的影响

拟南芥种子在Murashige和Skoog琼脂培养基上培养数天后开始发芽生长，纳米银处理组、Ag 处理组和对照组之间的发芽差异无统计学意义(数据未显示)。然而，随着幼苗的生长，AgNPs和Ag对根长和鲜重有明显的抑制作用，AgNPs比Ag具有更强的抑制作用。图1显示AgNPs和Ag以浓度依赖性的方式对根伸长产生了显著的抑制作用。0.5 mg/L AgNPs处理组和3.0 mg/L AgNPs处理组的根长分别为对照组的75.4%和34.5%;两周后分别为91.67%和58.6%。暴露在0.2mg/L的AgNPs中不影响根伸长。只有最高浓度的Ag 在暴露一周后对根伸长有显著抑制作用，根长下降到对照的64.5%。然而，在暴露两周后，它不再抑制根伸长，而最低浓度的Ag （0.2mg/L）则略微增加了根伸长。虽然AgNPs抑制根伸长，但它们引起根数的显著增加。暴露两周后，对照组和处理组的幼苗根系伸长；然而，0.5和3.0mg/L AgNPs处理组的伸长率慢于对照组和Ag 处理组。相应地，随着AgNPs浓度的升高，拟南芥的鲜重显著降低。在3毫克/升的AgNPs暴露一周和两周后，幼苗的鲜重分别降至对照组的57.3%和46.1%，暴露于0.2和0.5 mg/L AgNPs不受影响。三种浓度的Ag 均不影响幼苗暴露一周和两周后的新鲜重量（表1）。

图1 暴露于Ag 和AgNPs一周及两周后，拟南芥根系伸长的相对抑制率。相对于对照组，*和**分别代表p＜0.5和p＜0.01时的差异。

表1 AgNPs和Ag 处理后叶片鲜重、叶绿素和花青素含量的变化

数据以均数plusmn;SEM表示;相对于对照组，*和**分别代表p＜0.5和p＜0.01时的差异。Fw表示鲜重。

2.2 AgNPs和Ag 对植物组织叶绿素、花青素和金属含量的影响

叶绿素是反映植物生长状态的重要生物标志物。从表1中可以看出，AgNPs和Ag 均可使拟南芥幼苗2周后的cl -a、cl -b和总chl含量下降。0.5 mg/L和3.0 mg/L的AgNPs显著降低了两组中Chl-a的含量，降至对照组的60.9%，但相同浓度的Ag 使Chl-a的含量降至对照组的约78.1%。在0.2mg/L时，AgNPs和Ag均未显著改变Chl-a含量。高浓度的AgNPs和Ag（0.5和3.0mg/L）也显著降低了Chl-b的含量，Ag 比AgNPs具有更强的抑制作用。AgNPs对总Chl含量的影响与它们对Chl-a和Chl-b的影响相似。0.5 mg/L和3.0 mg/L的AgNPs显著降低了总chl含量，分别为62.4%和63.5%;而0.5 mg/L和3.0 mg/L的Ag 仅使总chl含量分别降至对照组的78.8%和81.2%。

拟南芥植物在AgNPs和Ag 中的暴露导致不同程度的花青素积累。暴露在0.5和3.0毫克/升的AgNPs后，花青素含量分别增加到对照的2.81倍和4.2倍；暴露在0.5毫克/升Ag和3.0毫克/升Ag 的一周后，也增加到对照的2.05倍和2.29倍（表1）。然而，在0.2mg/L的AgNPs和Ag 中，花青素含量没有明显变化。花青素含量随暴露时间的增加而逐渐增加，在接触0.5和3.0mg/L的AgNPs后，分别达到对照的3.41倍和5.99倍；暴露在0.5和3.0mg/L Ag 两周后，它也增加到对照的2.46倍和3.8倍。

为了收获足够的材料来分析AgNPs和Ag 对幼苗金属离子吸光度的影响，我们将暴露浓度降低到2.0mg/L（表2）。对照组叶片中的银含量极低，可能表示机器的检测阈值。然而，AgNP处理植物叶片中的Ag含量达到3137.63mu;g/g，高于Ag 处理植物叶片中的Ag 含量，其银含量积累仅为804.73mu;g/g。在AgNPs处理的组中，叶片中K、Fe2和Zn2显著降低，分别为对照组的71.4%、50.3%和49%。用AgNPs处理后，Na、Mg2和Ca2含量略有下降，但降幅不明显。所有这些金属离子的吸收不受Ag 处理的影响。

表2 3 mg/L AgNPs和Ag 处理2周后幼苗(叶片)金属离子含量的变化

数据以均数plusmn;SEM表示;不同字母表示差异有统计学意义（p lt; 0.05）。

2.3AgNPs和Ag 对叶片细胞超微结构的影响

经3.0 mg/L AgNPs和Ag 处理的植物叶片透射电镜图像如图2所示。我们观察到AgNPs和Ag 处理后细胞体积减小，而AgNPs处理后叶绿体略变扁平(图2a-c)。在AgNPs处理后，基粒片层变薄且模糊，类囊体膜之间的距离变宽(图2e)。在Ag 处理后，叶绿体的结构没有明显变化，除了基粒片层与对照相比变得稍微模糊(图2f)。此外，AgNPs处理后叶绿体中的嗜盐小球粒增多(图2e)，但Ag 处理后没有变化(图2f)，只有AgNPs处理组细胞间隙中有大量的电子致密沉积(图2e, h, j)。这些黑色的沉积物是AgNPs，表明AgNPs可以被根吸收并转移到叶子上。

图2 用透射电镜观察经AgNPs和Ag 处理2周后拟南芥叶绿体的变化。（a）对照组中的叶肉细胞结构；（b） AgNPs处理样品中的叶肉细胞结构；（c）Ag 处理样品中的叶肉细胞结构；（d）和（g）对照中的基粒片层；（e）和（h） AgNPs处理样品中的基粒片层；（f）和（i） Ag 处理样品中的基粒片层；（j）和（k） 在(h)中矩形内面积的放大图像。C:细胞，CP:叶绿体，thy:类囊体，OG:嗜

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