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一种新型WRKY转录因子：马豆MuWRKY3增强了转基因花生植物的干旱胁迫耐受性

干旱胁迫对花生的生长，水分关系，光合作用和产量有不利影响。 WRKY转录因子是植物特异的转录因子，它调节几个下游胁迫响应基因，并在植物生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用。我们发现，WRKY3基因在干旱胁迫条件下高度上调，因此从适应干旱的马豆中分离出一个新的WRKY3基因。保守域研究表明，该基因编码的蛋白质包含两个WRKY域和两个C2H2锌指基序的高度保守区域。 瞬时MuWRKY3-YFP的融合蛋白定位研究揭示了其核定位。与野生型（WT）植物相比，MuWRKY3基因在花生中过量表达显著提高花生对干旱胁迫的耐受性。 在施加干旱胁迫10天后，转基因花生的萎蔫症状减少且延迟。与干旱胁迫下的野生植物相比，过表达MuWRKY3基因，花生植株中的丙二醛，过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂^●－）的积累减少，但游离脯氨酸，总可溶性糖含量和抗氧化酶活性增加。此外，在转基因花生植物中发现了一系列与胁迫相关的LEA，HSP，MIPS，APX，SOD和CAT基因上调。 研究表明， MuWRKY3转录因子调节应激反应基因的表达和ROS清除酶的活性，从而提高花生的耐旱性。我们得出的结论是，MuWRKY3可以作为提高植物抗逆性的新的候选基因。

关键词：MuWRKY3 转录因子；耐旱性；转基因花生；胁迫响应基因； ROS；抗氧化代谢

背景：

干旱，高温，盐分和寒冷等非生物胁迫是导致全球农作物生产力下降的主要原因。 为了应对压力，植物已经进化出复杂的生理和分子网络。 干旱是一种严重的环境因素，严重限制了植物的生长和生产力。 干旱胁迫会导致农作物植物细胞膜发生变化，渗透物积累，抑制光合作用特性，降低生物量产量并增加产量。在分子水平上，几种转录因子如AP2 / EREBP，NAC，WRKY，bZIP，MYB和bHLH在调节下游基因以保护植物免受干旱胁迫方面起着至关重要的作用。WRKY转录因子是植物界中植物特异性调节蛋白的主要家族之一，已知参与生物和非生物胁迫反应。转录因子通过与基因启动子中存在的特定顺式作用元件相互作用，从而调节下游元件的表达，在应激反应中发挥重要作用。所有WRKY 转录因子都包含一个或两个保守结构域，该结构域具有大约60个氨基酸残基，其中包含一个保守的七肽WRKYGQK，以及一个C2H2或C2HC锌指状基序。WRKY域与靶基因的TTGACC/T W-box结合，调控其转录。根据WRKY结构域的数量和锌指基序的特点，将WRKY 转录因子分为三组，第一组转录因子的各个域在功能上呈现多样性；C端域有助于与W-box的特异性结合，而N端域则参与增加亲和力。在正常生长条件下，WRKY 转录因子的部分成员发挥调控作用，如毛状体发育、根系生长、种子发育、叶片衰老，休眠，和次生代谢物生物合成。一般而言，WRKY 转录因子可通过正向或负向调控下游相关基因，在植物中发挥多种作用。

推导出的大部分WRKY 转录因子因其在生物应激反应中的作用而为人所知。NtWRKY3和NtWRKY6转录因子在草食动物攻击期间的烟草中表达。Lai等报道了AtWRKY3和AtWRKY4在感染灰斑葡萄球菌的拟南芥中的转录丰度升高。目前的研究重点是WRKY蛋白在非生物胁迫下的功能表征。单个WRKY基因的上调或下调均可导致非生物胁迫耐受性的改善。 一些响应非生物胁迫的WRKY基因家族成员也有报道，如WRKY25、WRKY26、WRKY33等。WRKY 转录因子被认为可以调控乙烯与热休克蛋白反应相关信号通路的相互作用。在PEG、NaCl、寒冷和H₂O₂处理期间，小麦中多种非生物胁迫响应性TaWRKY10表达上调。与其他非生物胁迫相比，很少有WRKY转录因子是专门针对干旱胁迫反应的。研究了拟南芥AtWRKY57、大豆GsWRKY20和玉米ZmWRKY58在干旱条件下的表达。WRKY基因在植物中的过表达增强了几种非生物耐受性压力。例如，OsWRKY11在水稻中的过表达增强了水稻对高温和盐的耐受性。此外，几种棉花WRKY基因（GhWRKY17、GhWRKY34和GhWRKY41）的过表达也表明烟草的耐盐性和耐旱性增加。此外，两种小麦WRKY基因（TaWRKY19和TaWRKY93）在拟南芥中的过表达使小麦对盐和干旱胁迫具有更高的耐受性。这些基因通过清除细胞毒性化合物（ROS和RCC）的解毒作用，改善渗透调节，维持膜的稳定性，并通过调节应激反应基因，赋予植物对非生物胁迫的耐受性。尽管少数研究人员报道了WRKY 转录因子在模型植物非生物胁迫反应中的作用，但大多数来自非模型植物的WRKY 转录因子的功能仍未得到充分的研究。马豆科植物是一种适应干旱的粮食作物，它有一种独特的能力，可以在贫瘠的土壤中生长。花生是一种重要的油料作物，生长在世界半干旱地区的雨水灌溉地区，经常遭遇不同持续时间和强度的干旱。考虑到花生在旱地农业中的重要性，花生的耐旱性成为花生改良的重要课题。考虑到WRKY 转录因子在复杂的环境条件下的多种功能，为了进一步了解WRKY 转录因子的功能，我们从马豆中分离并鉴定了干旱应激反应的MuWRKY3基因。与野生型相比，过表达MuWRKY3的转基因花生植株表现出更强的抗旱性，表明MuWRKY3可以作为提高作物抗旱性的新候选基因。

材料和方法

植物材料和胁迫处理

在天然光周期条件下，在植物园中进行盆栽马豆19天（10-12 h； 27plusmn;4℃）。胁迫处理包括：（1）干旱胁迫，通过截留水分和叶片样本来施加给植物萎缩阶段, （2）盐胁迫，加入2% NaCl溶液施加盐胁迫，处理后72 h收集样品，（3）脱水胁迫，脱落的叶片在环境条件下在滤纸上干燥8小时，（4）寒冷胁迫，盆栽受到10℃ 48 h,（5）对于热胁迫处理植物，在一个温度控制的生长室内将其置于50℃下8小时。样品在液氮中快速冷冻，并在-80℃保存，以供进一步分析。

RNA提取和实时荧光定量PCR分析

用TRIzol试剂法提取马豆总RNA。采用TURBO DNA-free试剂盒。用200ng RNA合成cDNA，并以此为模板进行PCR和定量RT-PCR分析。表达分析采用荧光定量PCR系统，3个生物重复，以actin为内参。使用2^{-Delta;Delta;Ct}相对量化研究方法评估量化转录水平的变化之间的三个复制。

MuWRKY3基因克隆与系统发育分析

使用基因特异性引物扩增来自马豆cDNA的全长基因。扩增的全长产物克隆到pTZ57R/T载体上并进行测序。从植物转录因子数据库中下载不同植物的WRKY3序列，并与MuWRKY3序列进行比较。使用ClustalX软件进行多序列比对。采用无根邻接树进行系统发育树分析。树视图软件生成了一个图形表示，并使用1000个引导复制和111个随机奇数估计内部分支支持。利用NCBI保守域数据库预测保守域。利用在线软件Expasy1对其分子量和等电点进行了预测。亚细胞定位由Plant-mPLoc 2.02预测。

载体构建和植物转化

在组成型35S启动子的作用下，将全长基因克隆到双元载体pCAMBIA2301上，得到过表达MuWRKY3的基因结构。农杆菌EHA105携带CaMV35S:MuWRKY3，卡那霉素为可选标记物，用于植物转化。转基因植物是通过植物转化产生的。MuWRKY3基因融合YFP （35S:MuWRKY3::YFP）用于定位研究。MuWRKY3基因在pDONOR207 （Invitrogen）中使用gateway克隆法克隆，随后克隆成双元载体pAM-PATp35S-YFP。将表达pAM-PAT-p35S-MuWRKY3-YFP和pAM-PATp35S-YFP的植物表达载体转化为农杆菌EHA105株。

亚细胞定位和反式激活实验

利用无针注射器将携带pAM-PAT-p35S-MuWRKY3-YFP和pAM-PAT-p35S-YFP的农杆菌EHA105导入烟草叶片中。培养48 h后，观察叶片黄色荧光蛋白（YFP）信号。在515 nm处进行YFP激发，使用共聚焦激光扫描显微镜在525-600 nm范围内发现发射。采用酵母单杂交AH109对MuWRKY3基因的反活化活性进行了研究。将携带MuWRKY3 （pBD）、His-tag报告基因（pGBKT7-MuWRKY3）和pBD的载体pGBKT7转化进入酵母，参照Clontech酵母协议手册。采用菌落PCR法筛选阳性菌落。将酵母株条带于含有5mM 3-氨基- 1,2,4 -三唑（3-AT）的SD/-Trp和SD/-His板上进行转录活性测定。

基因整合与过表达分析

从T0植株上收获的种子在含有200 mg/L卡那霉素的MS培养基上播种，选择卡那霉素存活植株作为真转化子。利用基因特异性WRKY3、NptII和GUS引物对基因组DNA进行PCR分析，进一步证实了转基因的存在和整合。对推测转化子和WT的幼苗进行GUS（beta;-葡萄糖苷酸酶）酶活性测定。经鉴定，阳性转基因植株进一步传代。利用PCR扩增的方法，对推定的转基因植株进行T2和T3种子的筛选。QRT-PCR用于定量转基因的转录丰度。对T3代转基因株系进行南方印记分析，确认其稳定的转基因整合。基因组DNA经37℃ BamHI酶切，GUS探针分析。使用GUS探针的生物素标记PCR扩增基因片段进行印记分析。杂交膜按照制造商的说明清洗和检测。

转基因和野生型植株的抗逆性测定

为了评估耐旱性，盆栽培育了30日龄的转基因花生，野生型植株通过10天不浇水来应对干旱胁迫。记录了野生型和转基因花生植株的表型差异。

统计分析

为了检验所有生理生化实验的显著性差异，采用SPSS统计数据软件（16.0版），采用单因素方差分析（one-way ANOVA）事后多重比较邓肯检验，P lt;0.05为显著性水平。

结果

不同胁迫处理下MuWRKY3的表达模式

通过RT-PCR定量分析，确定了在非胁迫和几种施加的非生物胁迫下马豆叶片组织中MuWRKY3的转录丰度模式。结果表明，在脱水、干旱、高温、盐和低温处理下，叶片组织中均有MuWRKY3的表达。虽然WRKY3基因在所有胁迫条件下均高度上调，但在干旱胁迫条件下表达显著升高（图1A）。而不是在其他压力下。盐胁迫（200mm NaCl）处理使MuWRKY3转录丰度增加3.4倍，热胁迫增加6.1倍，低温（冷）处理使其上调5.0倍。在脱水和干旱处理期间，MuWRKY3的转录分别显著上调9.4倍和13.5倍。

MuWRKY3的克隆和序列注释分析

马豆适应半干旱条件，抗旱性强。在我们之前的研究中，我们发现MuWRKY3基因在八个不同的WRKY基因中被高度上调。在本研究中，从马豆中成功分离到全长WRKY3基因，并将其命名为MuWRKY3 （GenBank登录号:KM520390.1）。序列分析表明，MuWRKY3基因为1476 bp，编码约490个氨基酸，分子量为53.7 kDa，等电点为6.12。MuWRKY3蛋白保守域分析显示，存在两个WRKY结构域和一个C2-H2锌指基序，属于WRKY 转录因子超家族I组。

MuWRKY3与其它WRKY蛋白的系统发育关系

为了表征分离出的MuWRKY3蛋白与其它植物WRKY3蛋白的差异，我们通过ClustalX比对分析了结构域蛋白（图1B）。系统发育分析表明，MuWRKY3属于WRKY 转录因子家族I类，相对于NaWRKY3、GhWRKY3、AtWRKY3、BpWRKY3、BrWRKY3，与GmWRKY3的亲缘关系最接近。

图1 （A）荧光定量 PCR检测多种非生物胁迫下马豆中MuWRKY3的表达。误差棒表示三个不同字母的独立重复的标准差， P lt; 0.05为显著水平。（B） 来自不同物种的MuWRKY3和WRKY蛋白序列分析。利用ClustalX 2.1版对保守WRKY区域的氨基酸序列进行比对。MuWRKY3框在图中。

MuWRKY3基因定位于细胞核，具有转录活性<!--

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