纳米氧化铜和纳米氧化锌在植物相关系统中的联合效应：从土壤中的生物利用度到大麦中金属平衡的转录调节

原文作者：Izabela Josko ^a,*, Magdalena Kusiak ^a, Baoshan Xing ^b, Patryk Oleszczuk ^c

单位：a: Institute of Plant Genetics, Breeding and Biotechnology, Faculty of Agrobioengineering, University of Life Sciences, 13 Akademicka Street, 20-950 Lublin, Poland

b: Stockbridge School of Agriculture, University of Massachusetts, Amherst, MA 01003, United States

c: Department of Radiochemistry and Environmental Chemistry, Faculty of Chemistry, Maria Curie–Skłodowska University, Lublin, Poland

摘要： 人工纳米粒子(ENPs)在环境中的共存是一个尚待深入研究的新兴问题，本研究主要分析CuO和ZnO ENPs二元混合物在土壤植物体系中的去向。为了评价金属盐的纳米效应，将300mg/kg的ENPs单独或混合添加到土壤中，培养7天和30天，并从生物量、植物矿物组成和调节金属稳态的基因表达（ZIP1、6、8、10、14、RAN1、PAA1、2、MTP1、COPT5）和解毒（MT1-3）方面探究ENPs与土培大麦(Hordeum. Vulgare L.)之间的相互作用。采用0.01 mol/L CaCl₂萃取法测定Cu、Zn在土壤和根区的生物利用度。ENPs混合处理后，Cu、Zn的可提取浓度低于低于单独处理，而单独使用金属盐的趋势则相反。与金属吸收(ZIP)和细胞分化(PAA2，RAN1)相关的基因在单独使用金属盐处理后表达量大多上调，单独和混合使用的金属盐则会诱导这些基因的下调。

关键词：人工纳米颗粒；大麦；混合培养；萃取率；金属转运蛋白

1.引言

基于锌和铜的人工纳米颗粒(ENPs)在农业等许多领域有着广泛的应用(Rajput等, 2020b)。ENPs是直径在1-100 nm的颗粒，因其独特性质被用于更有效的作物施肥和保护过程(Kah ,2015)。全球年产ZnO ENPs和CuO ENPs分别在5500吨和200吨左右(Nair和Chung , 2017)。人们普遍认为，增加ENPs的生产和使用会导致它们更多地扩散到环境中(Keller等, 2013)。总纳米产物中，约9-38 %的ENPs最终转移到土壤中(Bundschuh等, 2018)。使用纳米农用化学物质导致土地污染被认为是ZnO ENPs和CuO ENPs进入土壤的主要人为途径 (Gao等, 2017; Rajput等, 2020a)。近年来，农业土壤中 ENPs 含量增加对环境的影响引起了人们的广泛关注。。(Gao等，2017)。

金属基ENPs一旦释放到土壤中，将进行溶解、磺化、吸附、聚集和氧化还原反应等各种转变(Lowry等, 2012)。这些过程的动力学取决于ENPs的类型和浓度以及土壤性质(pH ,土壤有机质(SOM)、粘土含量、阳离子交换容量(Gao等, 2017,2019 ; Jo acute; sko等 , 2020)。最近的研究表明，土壤生物和植物分泌的代谢物(Gao等, 2018; McManus等, 2018)可以调节ENPs的去向。根系分泌物是低分子质量化合物(例如氨基酸、有机酸、糖类、酚类)和包括黏液在内的高分子质量化合物的丰富混合物(Wang等, 2020)，根系分泌物会影响ENPs的聚集和溶解(Gao等, 2018; 尚等, 2019)。然而，大多数研究关注单个ENPs的去向，因此我们也必须考虑土壤系统中ENPs共存的情况。ENPs在化学、溶解性和电荷上的共现性不同，可能会造成相对于单独使用ENPs (邓军等 , 2017 )的转化率和转变方向的差异。因此，金属组分和ENPs本身对生物群的可利用性在共同污染条件下将发生变化。

基于金属的ENPs对土培植物的影响仍然是一个长期关注的话题(Rizwan等，2017)。ENPs对植物的有利和不利影响都有报道(Rico等, 2011; Rizwan等, 2017)。植物对基于金属的ENPs的反应在很大程度上取决于ENPs的类型和剂量、植物种类、生长和发育阶段，以及土壤特性和培养时间(Rizwan等, 2017)。最近，ENPs对植物的复合影响引起了越来越多的关注(Joacute;sko等, 2017; Pagano等, 2017; Singh和Kumar, 2020)。ENPs的二元混合物(纳米氧化锌 纳米氧化铜)对亚麻、小麦、水芹和黄瓜的根系伸长抑制比单一接触这些颗粒更低(Joacute;sko等, 2017)。相反，Singh和Kumar(2020)的研究显示，用纳米氧化锌和纳米氧化铜的混合物灌溉的菠菜的生物量减少量比在单个ENPs处理下更高。Pagano等(2017)观察到西葫芦在纳米二氧化钛/纳米氧化铝/纳米氧化铜/CdS QDs的二元处理和单一接触ENPs的情况下有不同的基因表达模式。ENPs的生物活性被归因于ENPs本身、释放的金属离子或两者兼有(Garciacute;a-Gacute;omez等, 2017)。在ENPs的复合影响下，预计离子和颗粒金属之间以及与生物分子之间会有更复杂的相互作用（吸附、竞争）(Deng等, 2017)。这些相互作用不仅影响植物的健康，而且还涉及到金属成分和ENPs在吸收和转移上的变化，以及ENPs在食物链中积累的风险(Deng等, 2017)。用纳米氧化锌和纳米氧化铜复合处理后，菠菜芽中的铜和锌含量高于单独处理(Singh和Kumar, 2020)。在西葫芦中观察到一个断裂趋势，nLa₂O₃和nCuO的混合物比单独使用ENPs提供的Cu在植物组织中积累量更低(Pagano等, 2017)。此外，许多研究表明，培养在ENPs的植物营养状况发生了变化(Nair和Chung, 2017; Rawat等, 2018; Cota-Ruiz等, 2020；Sharifan等, 2020)。随之产生的问题是，共存的ENPs将如何影响植物的矿物组成。

锌和铜在植物生长发育中起着关键作用(Bashir等, 2016)。Zn是300多种酶的辅助因子（如：RNA聚合酶、超氧化物歧化酶）(Bashir等, 2016)。铜有两种形式(Cu , Cu² )，是光合作用、氧化压力防御、荷尔蒙信号和其他生化过程所需的(Palmer and Guerinot, 2009)。其过量时，会发生非目标效应，导致细胞损伤(Bashir等, 2016; Kruml;amer等, 2007)。植物有多种方法来调整矿物质的吸收和分布(霍尔和威廉姆斯, 2003)。植物细胞内几乎没有游离的铜和锌，植物通过在细胞内协调参与金属获取、调动和固存的几种蛋白来管理其离子源(Nair and Chung, 2017)。一些基因家族已经被证明参与植物锌和铜的稳态：锌调节转运蛋白(ZRT)、Fe调节转运蛋白(IRT)-类似蛋白(ZIPs)、P型ATP酶重金属转运体(HMA)、金属耐受蛋白(MTP)、铜调节转运蛋白(COPT)(Hall和Williams, 2003)。有研究报道，在纳米氧化锌(Nair和Chung, 2017)和纳米氧化铜(Landa等, 2017)胁迫下，水培模式植物拟南芥中金属转运蛋白的基因表达发生变化。这两项研究都发现ENPs和金属盐参与金属稳态的基因下调。然而，在培养于混合ENPs的植物中，有关金属平衡相关基因的转录调控方面有待研究。根据Irving-Williams，二价金属对配体的相对结合力是Mn lt; Fe lt; Zn lt; Cu。因此，Cu和Zn有很大的潜力来取代必需蛋白质中的其他金属(Blindauer和Schmid, 2010)。在ENPs共存的情况下，金属的竞争和替代能力在植物体中可能会诱发出与单个ENPs处理所引起的不同的转录组反应。

为解决上述知识空白，本研究比较了ENPs(ZnO和CuO)及其金属盐(ZnSO₄、CuSO₄)单独和混合作用对土培大麦(Hordeum vulgarise L)的影响。在土壤中，通过CaCl₂萃取分析ENPs金属组分的生物利用度，可确定引起阳离子交换的金属浓度(Gao等, 2018)。从生物量、矿物组成和调控金属稳态的基因表达等方面比较ENPs金属组分的可提取浓度与植物响应差异。我们假设，与单一处理相比，使用混合ENPs培养会对植物产生不同的生理、化学和转录效应。此外，ENPs造成的影响可能与金属盐类造成的影响不同。本研究对ENPs在土壤和植物中的相互作用进行探索，可以为分析ENPs金属组分提供新的见解。

2.材料与方法

2.1实验材料

CuO ( nano CuO )和ZnO ( nano ZnO )纳米颗粒（纯度ge;95.5%）购自Sigma-Aldrich（美国）。用透射电子显微镜(JEM-3010 TEM JEOL, Ltd., Japan)测定的纳米氧化锌和纳米氧化铜的主要颗粒尺寸分别为100plusmn;25纳米和50plusmn;10纳米。ENPs的TEM图像显示在补充材料中(图S1)。金属盐ZnSO₄和CuSO₄（纯度ge;95.5%）用于比较金属的微粒(ENPs)和离子形式的不同。采用Empyrean（PANalytic ,荷兰）X射线衍射仪测定ENPs的晶体结构。将记录的XRD图谱与国际衍射数据中心(ICDD)PDF-2数据库进行比对鉴定。根据XRD图样(图S2)，氧化锌和氧化铜粉末中分别确定了氧化锌结构（参考号04-013-7122）和黑铜矿结构（参考号04-005-4712）。未观察到典型可能杂质的峰。衍射峰较窄，揭示了纳米ZnO和纳米CuO的结晶相。

2.2实验设计

实验采用标准LUFA 2.3土壤(Lufa Speyer, 德国)。补充材料列出了土壤的性质(表S1)。将风干的土壤样品(100g)放入聚乙烯探针中，以粉末形式用ENPs或金属盐进行修饰。干式加药是一种适合ENP在土壤中均匀分布的方法(Tatsi等, 2018)（经处理的土壤样品中锌和铜的高回收率(93-95%)证实了这一说法）。用这些化合物对土壤进行处理，即单独使用纳米氧化锌、纳米氧化铜、硫酸锌或硫酸铜(300 mg Zn/Cu kg—1)以及纳米氧化锌 纳米氧化铜或硫酸锌 硫酸铜的二元混合物（按1：1的比例）。300 mg kg—1的浓度代表土培植物的ENPs中等暴露情况(Peng等, 2017; Gao等, 2018)。因为ENPs的溶解是一个随时间变化的过程；使用了ENPs和金属盐的等摩尔浓度。样品在涡流向导(VELP Scientifica Srl.，意大利)中混合，并分成两部分：65克用于植物生长，35克用于化学分析。所有土壤样品都用Milli-Qreg;水浇灌，以达到40%的持水量。样品在黑暗中保存在23plusmn;3◦ C。

2.3植物生长

本研究采用最重要的作物植物之一大麦(Genc等, 2002)，它具有对铜和锌过量和缺乏的低、中等耐受性(Alloway, 2008)。大麦(Ella)种子用Milli-Qreg;水浸泡2h。用2%的次氯酸钙对种子进行表面消毒15分钟，然后用70%的乙醇消毒1分钟，再用Milli-Qreg;水冲洗3次。灭菌后的种子被转移到含有用Milli-Qreg;水浸泡过的滤纸的培养皿中。培养皿放置在23◦C的黑暗中的生长室中。4天后将幼苗移植到装有土壤样品的试管中。这些植物被放置在生长室(Conviron GEN1000，加拿大)内，相对湿度为60%，16小时光照/8小时黑暗循环，温度为23^◦C/18^◦C。每天向每个试管中加入1毫升Milli-Qreg;水以保持湿度。7天和30天取样，取样时立即将部分叶片(约500 mg)在液氮中研磨以进行RNA分离，剩余的叶子用Milli-Qreg;水冲洗后进行金属含量分析。根部放入2.2 mol L^-1 HNO₃中30秒，然后用Milli-Qreg;水冲洗3次，以去除附着在根部的土壤颗粒和附着在根部表面的ENPs。叶片和根部烘干、称重并储存(20◦C的黑暗环境中)待后续进行金属含量分析。

2.4土壤分析

培养7、30天后取土样进行分析。选择CaCl₂萃取液测定未种植土壤（以下为块状土壤）和种植土壤靠近植物根系（以下为生根区）的金属潜在生物可利用浓度。为了收集附着在根上的土壤（生根区），将试管剪下，将根中大量覆盖着土壤团聚体的土壤转移到装有Milli-Qreg;水和手摇的50mL试管中。待土壤被风干，取块状土壤和生根区样品进行化学提取(Gao等, 2017)。将20 mL 0.01 mol L^-1 CaCl₂溶液与2 g土壤混合均匀，混合物在180 rpm (JW Electronic WL-2000，波兰)振荡2 h。提取4000 g样品，并通过0.45 micro;m PTFE过滤器(M

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