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氧化铈纳米颗粒对秀丽隐杆线虫的毒性大于相等摩尔体积氧化铈的毒性

摘要

工程型氧化铈纳米粒子(CeO₂NPs)广泛应用于生物医学和工程制造行业。此前的研究表明，CeO₂ NPs具有氧化还原催化剂的作用，而且还有诱导和缓解机体氧化应激的潜能。在这项研究中，秀丽隐杆线虫和斑马鱼(Danio rerio)使用了市售的CeO₂NPs。非纳米氧化铈粉末(CeO₂)被用作铈毒性的阳性对照。CeO₂NPs悬浮在以美国环境保护署为标准的重组中等硬度的水中，用于培养秀丽隐杆线虫，迅速形成大的多分散聚集体。每日更新给药溶液，连续3天。野生型线虫暴露后，在3天内均检测到剂量依赖性的生长抑制（P lt; 0.0001），但与CeO₂ NPs暴露相比，同等质量暴露的抑制程度更小。一些金属和氧化应激敏感的突变线虫菌株在第2和3天用5 mg/L的CeO₂NPs处理时，表现出相对于野生型的轻微生长改变，这为氧化应激或金属敏感性在CeO₂ NPs毒性中的作用提供了微弱的证据。与对照组相比，微注射CeO₂NPs或CeO₂的斑马鱼没有表现出明显的发育缺陷。高光谱成像显示，在秀丽隐杆线虫细胞内可检测到CeO₂ NPs。在中观察到的生长抑制至少可以部分解释为CeO₂NPs聚集在细菌食物周围和/或肠道内引起的非特异性喂养抑制。在线虫中观察到的生长抑制至少可以部分解释为CeO₂NPs聚集在细菌食物周围和/或肠道内引起的进食非特异性抑制。纳米技术是当今发展最快的领域之一，到2015年，它的市场价值预计将达200～300亿美元(McWilliams 2010). 纳米材料现在被用作多种消费品的添加剂，包括柴油燃料(Park et al. 2008a, b),服装(Gorensek and Recetj 2007),防晒霜和化妆品(Nohynek et al. 2007),以及各种工程应用，包括电子显示器(Bach et al. 2002)。

氧化铈纳米颗粒

氧化铈纳米颗粒(CeO₂NPs)，也被称为纳米陶瓷，是目前生产中最具经济价值的制造纳米颗粒之一(Wang et al. 2008)。它们被用于催化剂(Zheng et al. 2005)，太阳能电池板和燃料电池(Murray et al. 1999; Corma et al.2004)，作为柴油燃料添加剂(Park et al. 2008a, b)。以及用于玻璃和陶瓷的应用(Eom and Choi 2009)。铈是一种镧系稀土元素，既可以作为自由金属的形式存在，也可以在铈(III)和铈(IV)氧化态之间循环存在(Heckert et al. 2008)。纳米陶瓷也可在Ce(III)和Ce(IV)价态之间循环，它们包含氧空位，允许纳米颗粒作为再生催化剂（Heckert et al. 2008）。CeO₂NPs的氧化还原循环能力可能通过氧化应激途径使其具有生物活性(Di Giulio and Meyer 2008)。

有些有限的数据显示CeO₂NPs在体内的毒性。Van Hoecke等人(2009)使用了四种标准的测试生物——近头状尖胞藻，一种单细胞藻类;两种甲壳纲动物，大型水蚤和丰年虫;斑马鱼(Danio rerio) -胚胎。当CeO₂NPs浓度为2.6～5.4 mg/L时，有10 %的效应浓度对亚头盖骨瓢虫产生慢性毒性，而食物短缺增加了大头盖骨瓢虫的毒性。在培养基中暴露于CeO₂NPs的斑马鱼胚胎没有观察到毒性(Van Hoecke et al，2009)。Johnston等人(2010)通过水和饮食作用于斑马鱼成虫中，发现仅通过水作用于斑马鱼的鱼肝脏能显著摄取CeO₂NPs。

关于CeO₂NPs作为促氧化剂或抗氧化剂的证据

有证据表明，CeO₂NPs在体外诱导氧化应激反应。Lin等人（2006）的文章中显示，人支气管肺泡癌细胞暴露于不同浓度的CeO₂NPs后，细胞内二氯荧光素水平呈剂量依赖性增加。此外，暴露于CeO₂NPs的人支气管上皮细胞表现出明显的抗氧化活性，氧化应激相关基因的表达增加，包括过氧化氢酶、谷胱甘肽s-转移酶、血红素加氧酶-1和硫氧还蛋白(Park et al. 2008a, b)。

相反，也有证据表明，CeO₂NPs可以减轻氧化损伤。CeO₂NPs抑制了暴露于柴油排气颗粒提取物的细胞中活性氧的产生(Xia et al. 2008)。Das等人（2007）发现，单剂量的纳米摩尔浓度的CeO₂NPs在培养数天后存活的大鼠脊髓神经元的数量显著增加，并保护过氧化氢暴露后的神经元免受损伤。在一项为数不多的用CeO₂NPs进行的体内研究中，Niu等人（2007）发现纳米角藻在MCP-1转基因小鼠中部分预防了心脏功能障碍，并减少了炎症和凋亡因子，这些小鼠通常表现出进行性心脏损伤。CeO2 NPs的抗氧化性能可能是由于Ce³ 和Ce⁴ ，这使得二氧化铈能够清除自由基(Das et al. 2007)。

因此，目前关于CeO₂NPs的促氧化剂或抗氧化活性的数据是相互矛盾的，而且大部分局限于体外研究。本研究在斑马鱼和秀丽隐杆线虫两种体内系统中研究了CeO₂ NPs的毒性潜力，采用野生型和基因缺陷线虫菌株，探索氧化应激在体内CeO₂ NP毒性中的作用。

材料和方法

CeO₂NPs表征

使用Sonicator 4000 (Misonix, Qsonica LLC, Newton, CT)将CeO₂NPs(纳米结构和非晶材料，TX)悬浮在双去离子水(ddH2O)中10分钟。用含氦氖激光(633.4 nm)的CGS 3光谱仪(ALVGmbH, Germany)动态光散射(DLS)对25 ℃浓度的悬浮液中颗粒的尺寸分布进行了表征。电泳迁移率测量使用Zetasizer NanoZS (Malvern, UK)与633.4 nm氦氖激光。光电倍增管设置为90角，温度为25℃时进行测量。非纳米氧化铈粉末(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)在ddH₂O中超声悬浮10分钟。

秀丽隐杆线虫暴露在纳米颗粒中培养

线虫在添加了OP50菌株的大肠杆菌的琼脂平板上生长，以提供细菌食物。使用的菌株包括野生型N2 Bristol，获得自秀丽线虫遗传中心(CGC;明尼阿波利斯,MN);菌株JF23 (metallothionein deletion，简称asmtl-2) (Freedman etal . 1993)，来自J. Freedman和W. Boyd (NIEHS, RTP, NC)的馈赠; 菌株VC433(线粒体超氧化物歧化酶-3缺失，称为sod-3) (Hunter等人，1997);和菌株TM1748 (phytochelatin synthase-1缺失，简称pcs-1) (Vatamaniuk et al. 2001)，从CGC中获得。根据已知的对金属暴露和氧化应激的敏感性来选择菌株(Yang etal . 2012)。

在美国环境保护署(USEPA)重组的中等硬水(USEPA MHW)中进行了液体介质暴露，以提供适当浓度的离子供蠕虫生存，同时最大限度地减少CeO₂ NP聚集。美国环保局MHW含有96毫克NaHCO₃, 60毫克MgSO₄, 60毫克CaSO4₂H₂O和4毫克KCl在1升ddH2O中(美国环保局2002)。给药后的线虫置于20℃的暗培养箱中。所有给药均在96孔或48孔的塑料板上进行，分别用于COPAS生物分类和光镜实验，使用L1幼虫，如Meyer等人(2007)所述，L1幼虫的年龄是同步的。加药溶液用ddH₂O连续稀释原液溶液制成。给药液中加入终浓度为1 lL/mL的胆固醇。USEPA MHW的pH值为7.08，添加氧化铈溶液仅使pH值从7.17略微升高至7.19。线虫被喂食紫外线(UV)灭活的大肠杆菌，每天更新大肠杆菌以提供充足的生长营养，而不过量。细菌食品是由Arch Environ Contam Toxicol(2013)使用从(Yang et al. 2012)改进的方法制成的。通过将UvrA菌株大肠杆菌(Croteau et al. 2008)暴露于254 nm杀菌紫外灯的UVC辐射中，细菌被灭活。使用灭活细菌来消除由于纳米颗粒暴露导致的细菌食物供应死亡而引起的任何混杂的生长抑制。细菌食品是通过在Luria-Bertani (LB)肉汤中培养大肠杆菌16小时，形成大约3.4 9 108个细胞/mL的原液，之后将6毫升大肠杆菌培养物分散在150毫米的培养皿上，暴露于1500 J/m2的UVC中，大约每30秒温和搅拌一次(暴露时间约为5分钟)。利用带有UVX-25传感器的UVX辐射计测量irra距离。细菌原液在4℃保存B1周。将灭活菌以15000转/分的转速离心3分钟，抽吸LB肉汤，然后将菌液重悬于USEPA MHW中，浓度为1:200(第0天)、1:100(第1天)和1:20(第2天)。这足以为线虫提供适当水平的营养，而不是过量。随着线虫的生长，每天增加细菌食物的浓度，以提供充足的食物供应。

使用 COPAS Biosort (Union Biometrica, Holliston, MA) 将每孔 50 条线虫与 4 次重复/菌株/天接种到 96 孔板中。 线虫在铺板前的 L1 阶段被饥饿和年龄同步。 所有线虫都悬浮在 USEPA MHW 和 CeO₂ 溶液中或（对照）仅悬浮在 USEPA MHW 中，总剂量为 100 mu;L。每天在 COPAS Biosort 上使用 LASER 测量消光系数和飞行时间，持续 3 天。用 2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 和 75.0 mg/L 的非纳米 CeO₂ 粉末悬浮液（称为 CeO₂）对线虫给药，作为对氧化铈可能引起的毒性的阳性对照。 CeO₂ NPs 的剂量为 2.5、5.0、12.5、25.0、62.5 和 93.75 mg/L，或 ddH₂O，作为对照。含有 7.5 M CdCl₂ 的 USEPA MHW 和含有 0.5 lM 百草枯的 USEPA MHW 用作阳性对照。每天为线虫补充 50% 的含有新鲜灭活细菌原液的给药溶液。将服用百草枯的线虫在 1.7 mL 微量离心管中暴露于1.5 mu;L百草枯 1 小时，然后如前所述将它们离心并用 1X EPA MHW 冲洗 3 次（Hunter 等人，2012 年）。在先前确定的最佳蠕虫生长条件下（Meyer et al. 2010），将给药的线虫在黑暗中 20°C 下储存，不要摇晃。实验至少重复两次。

使用 CdCl₂ 和百草枯的阳性对照实验是在没有使用 COPAS Biosort 的情况下手动进行的，因为 CeO2 NPs 难以堵塞机器。 用大约 300 条线虫/孔在 500 mu;L 给药溶液中手动铺板线虫。 使用 Zeiss Axioscop 显微镜 (Thornwood, NY) 和 NIS Elements BR 3.10 成像软件 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) 拍摄线虫。 ImageJ 软件 (NIH, Bethesda, MD) 用于测量拍摄的线虫。 实验重复两次。 使用 COPAS Biosort 和手动测量测定的生长测定数据使用百分比对照生长值组合。 还测试了第三个阳性对照 H2O2，但这被确定为对所测试的 sod-3 突变体不合适的阳性对照。 在线资源 2 中提供了其他数据。

溶解铈的分析

溶解的铈浓度是通过在 19 USEPA MHW 中以前面描述的剂量浓度在 12°C 下以 273,8659 g 离心 CeO₂ NPs 2 小时来测量的。将溶液在 1、2 和 3 天离心。离心后，去除上清液并消化在 0.5 mL 浓HNO₃中于 70°C 放置 1 小时，然后使其冷却；将 0.5 mL H₂O₂ 添加到消解物中。将溶液在 4°C 下储存过夜并用 8 mL ddH₂O 稀释，然后使用电感耦合等离子体质谱法进行分析。溶解氧化铈实验一式两份进行。

高光谱成像

野生型年轻成虫线虫与食物一起暴露于 12.5 mg/L CeO₂NPs 24 小时，然后使用装有高光谱成像系统 (CytoViva-Hypers

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