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水杨酸在拟南芥幼苗中氯化钠和渗透胁迫产生的氧化损伤中作用的证据

以往的研究表明，水杨酸(SA)是植物抗病原菌的重要组成部分。在现在的研究表明，SA在植物对不利环境条件的响应，如在盐胁迫和渗透胁迫中发挥了作用。我们研究了野生型拟南芥和一个表达水杨酸羟化酶(NahG)基因的sa缺陷转基因株系对不同非生物胁迫条件的响应。野生型植物在添加100mm氯化钠或270mm甘露醇的培养基中萌发，芽部广泛坏死，而在相同条件下萌发的NahG植物保持绿色，形成真叶。在相同条件下，NahG幼苗缺乏坏死，这表明SA在盐和渗透胁迫下增强了光合组织中活性氧的产生。这一假设是支持了以下观察：首先，除草剂甲基根，生成光合作用的超氧化物激进，只在野生型植物中产生坏死表型；第二，活性氧清除化合物的存在萌发介质逆转野生型坏死表型在盐和渗透胁迫；第三，与NahG幼苗相比，野生型幼苗在氯化钠胁迫下谷胱甘肽池的氧化状态明显增加；第四，通过脂质过氧化法测定，野生型幼苗在氯化钠胁迫下的氧化损伤比NahG幼苗的氧化损伤更大。我们的数据支持了SA增强萌发的拟南芥幼苗胁迫响应的模型。

环境胁迫如盐（氯化钠）和干旱是限制植物生产力的因素之一(格林威和Munns，1980年；Boyer，1982；Bohnert等人，1995)。随着农业发展强度的增加，这种压力正变得更加普遍。因此，如果我们要了解植物的响应，并将遗传或环境改良引入胁迫抗性，阐明植物感知和转导这些胁迫的机制是至关重要的。以往对许多植物物种的研究表明，干旱和耐盐受是发育调控的阶段特异性现象，因为植物发育的一个阶段的耐受与其他阶段的耐受不一定相关(劳奇利和爱泼斯坦，1990；Johnsonetal，1992)。因此，如果要了解在盐或其他非生物胁迫响应中起重要作用的生化事件，就必须研究植物发育特定阶段的耐受机制，如种子萌发。

盐胁迫会影响从种子萌发到植物发育的多个生理过程。植物对盐胁迫反应的复杂性可以部分解释为盐度既施加了离子胁迫又施加了渗透胁迫(帕斯捷尔纳克，1987)。光合作用是植物的关键代谢途径，是盐胁迫的靶点。盐胁迫下产生的脱落酸降低了保卫细胞的膨压，限制了CO₂可用于的光合作用(Leungetal，1994)。此外，在盐胁迫引起的水胁迫中，叶绿体基质体积的减少和活性氧(ROS)的产生也被认为在抑制光合作用中发挥了重要作用(PriceandHendry，1991)。叶绿体中可以通过叶绿素的激发能直接转移产生单线态氧，或通过光系统I的单价氧还原来产生(Foyeretal，1994；Allen，1995)。

水杨酸(SA)在许多植物对病原体攻击的防御反应中起着重要的作用。SA在超敏反应中介导的氧化爆发导致细胞死亡，并作为系统获得性抗性发展的信号(Shirasuetal，1997)。一些研究也支持SA在调节植物对几种非生物胁迫的响应中发挥的主要作用(Yalpani等，1994；Senaratna等，2000)。SA的一个已知的作用是参与了生热植物温度的升高(Raskinetal，1987)。用外源SA处理芥菜幼苗，提高了它们的耐热性和热驯化能力(Datetal，1998)。在玉米植株中，SA预处理诱导了抗氧化酶，这反过来提高了耐寒性(Jandaetal，1999)。最近的研究利用一个表达水杨酸羟化酶基因(NahG)的拟南芥转基因株系来减少并监测其对臭氧的反应(O₃).这一发现表明，SA是O₃所必需的通过维持细胞氧化还原状态和允许防御反应的耐受性(Sharmaetal，1996)。然而，通过使用一种积累了高水平SA的拟南芥基因型Cvi-0，我们发现SA激活了一种氧化爆发和一种细胞死亡途径，导致O₃敏感性(Rao和Davis，1999)。

盐胁迫和渗透胁迫均会导致氧化胁迫和严重损害幼苗的存活率。在本研究中，我们发现SA通过参与高盐和渗透条件引起的ROS介导的损伤，参与了植物对盐和渗透胁迫的响应。结果表明，SA通过增强拟南芥光合作用和萌发过程中ROS的生成，极大地增强了盐胁迫和渗透胁迫的作用。

结果

SA的缺失增强了拟南芥在盐胁迫和渗透胁迫下的萌发能力

以往的研究表明，SA在植物对不同类型非生物胁迫的敏感性中起着重要作用(Dat等，1998年；RaoandDavis，1999年)。然而，这些研究都没有提供关于SA在非生物胁迫中，如高氯化钠或渗透胁迫中的可能作用的信息。此前已经有研究表明，在中等光照强度下，拟南芥的盐胁迫敏感性会增加(Tsugane等，1999)为了研究SA在盐胁迫中的可能作用，将野生型拟南芥基因型(Ler)和缺乏SA的转基因NahG拟南芥种子在不同浓度的氯化钠下萌发。在100mm氯化钠时，野生型幼苗无法扩张和发育子叶，出现广泛的坏死，而NahG幼苗萌发和发育扩张的子叶和第一个真叶。1A)进一步观察幼苗的表型，发现受盐胁迫影响最大的部分是光合组织，通过分析野生型和NahG幼苗的根和茎的鲜重，证实了这一点。1A)在光照下的100mm氯化钠下生长15天后，NahG幼苗的枝条重量约为野生型的7倍。然而，根系在根系鲜重方面没有发现显著差异，尽管观察到不同的形态。在培养基中没有或存在氯化钠的黑暗中萌发时，NahG与野生型植物之间没有发现差异。1B)我们使用了一组特定的环境，如幼苗在琼脂平板和无菌条件下生长，因此，我们确定了类似的表型是否在更类似土壤的培养基中可重复，如珍珠岩和使用添加氯化钠的营养液。

图1.野生型和NahG幼苗在不同胁迫条件下的表型萌发。幼苗在培养皿上发芽，然后在光照下(约39micro;molm^-2s^-1)或在黑暗中。左图为15d后的盘子照片。然后收集幼苗并称重（右）。所示的照片代表了三个独立的试验，新鲜的重量值是三个不同实验的平均值(n=50)plusmn;SE.星号表示平均值差异

在野生型与NahG之间(Plt;0.05)。A,100m_M氯化钠在培养皿中的光线下。B,100m_M氯化钠在黑暗中的培养皿中。C,250m_M氯化钠在珍珠岩的光中。D,270m_M甘露醇在培养皿中的光照中。E,5n_M甲基维生素素(MV)在培养皿中的光照下。

图2.拟南芥生态型Cvi-0对氯化钠的敏感性高于Ler和NahG。野生型、NahG和Cvi-0幼苗在含有不同氯化钠浓度的小鼠和Skoog培养基中生长后的鲜重。幼苗在光照下(约39micro;molm^-2s^-1)，15d后收集幼苗并称重。如图所示的实验代表了三个独立的试验(n=50)。

如图1C所示，只有在高氯化钠条件下萌发的野生型中，才观察到类似的致死表型。然而，氯化钠浓度模仿这种表型是250毫米氯化钠拟南芥生态型，Cvi-0，过度积累SA在氧化应激被描述（RaoandDavis，1999）我们确定幼苗生长差异影响野生型，NahG和Cvi-0幼苗如图2所示，Cvi-0幼苗更敏感所有氯化钠浓度测试。

野生型和NahG幼苗对甘露醇被分析，以确定观察到的差异是由于渗透性还是由于氯化钠胁迫的离子成分。野生型种子萌发对270mm人更为敏感。

在光照下比NahG种子(图1d)。这表明，由氯化钠产生的渗透成分负责坏死表型。在甘露醇处理下，野生型和NahG幼苗的鲜重差异与氯化钠实验相似，这些差异也仅限于光合组织(图1d)。锂被认为是一种对钠的毒性更强的类似物，并已用于在不渗透胁迫下产生离子毒性(Wuetal，1996)。野生型和NahG在不同锂条件下的萌发率无差异 浓度（数据未显示）。这表明，氯化钠应力的离子成分本身并不会引起所观察到的坏死。

ROS介导SA应激反应

仅拟南芥野生型幼苗对盐敏感的耦合表明，高氯化钠增强了ROS的产生，而SA可能在某种程度上参与了ROS的增加。SA在ROS生成中的作用可以解释NahG幼苗对氯化钠耐受性的增加。为了验证这一假设，我们改变了野生型和NahG幼苗的ROS水平，看看它们是否模拟了盐胁迫或渗透胁迫。为了增加ROS水平，我们使用了电子转移解耦器MV。除草剂MV在光合作用过程中产生超氧自由基，对光系统I和II(Dodge，1994)野生型和NahG幼苗在不同浓度MV的存在下萌发。使用5nm的MV获得了与之前用氯化钠或甘露醇观察到的相似的表型(图。1E)NahG幼苗在萌发过程中的耐受性高于野生幼苗培养基中5nmMV产生的ROS增加。

图3.GSH和ASA提高了野生型幼苗对氯化钠胁迫的保护作用。野生型幼苗（白色条）和NahG幼苗（黑色条）在100m的草和Skoog培养基中生长后的鲜重_M氯化钠和3m_M还原性谷胱甘肽(GSH)或2m_M的ASA的。15d后采集幼苗并称重。所示的值是三个独立实验的平均值。误差条表示SE(n=30)。

表一.氯化钠胁迫后的GSH水平和GSH的氧化还原状态依赖于SA

为了降低ROS水平，我们使用了常见的猝灭剂，如还原性谷胱甘肽(GSH)和抗坏血酸(ASA)。因此，在萌发培养基中添加3mmGSH逆转了氯化钠对野生型幼苗的毒性作用，表明氯化钠胁迫下的氧化还原状态发生了变化(图.3)相比之下，添加氧化谷胱甘肽(GSSG)增加了氯化钠的不良影响NahG和野生型幼苗，他们都不能发芽在100毫米氯化钠（数据未显示）的添加2毫米ASA也提高了野生型幼苗的萌发和生长在100毫米氯化钠。

因为我们确定了增加了GSH在培养基可以缓解种子萌发过程中的氯化钠表型，我们测定了野生型和NahG植株在氯化钠胁迫后的谷胱甘肽水平(表I)。氯化钠降低了野生型幼苗的GSH和GSSG的含量。这导致GSH/GSSG比值从6.6降低到0.6。在NahG植株中，GSH/GSSG比从7.2下降到2.8。

SA在NahG植株中转化为邻苯二酚。因此，我们想确定观察到的差异不是由于可能在NahG幼苗中积累的儿茶酚的抗氧化特性。在100mm氯化钠下的野生型和NahG植物的培养基中使用不同浓度的儿茶酚的实验没有显示出显著差异（数据未显示）。

SA增加了氯化钠诱导的脂质过氧化作用

氧化损伤可以通过监测脂质过氧化反应的变化来评估(Raoetal，1997；Rao和Davis,1999)。为了确定氯化钠是否引起了野生型和NahG幼苗的氧化损伤，我们在中等光照或黑暗条件下，通过测量不同氯化钠浓度下的硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)来监测脂质过氧化的变化（图4）。增加氯化钠浓度，增加了野生型和NahG植物在光照下的脂质过氧化作用。在高氯化钠浓度下，野生型植株的增幅明显高于NahG植株。当在黑暗中进行氯化钠处理时，没有观察到显著的差异(图4)

RD29A、PR1、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的表达分析

为了研究SA、氯化钠应激和氧化应激之间的关系，我们分析了RD29A、PR1和GPX基因的表达，这些基因的表达分别在氯化钠、SA和氧化应激后增加。RD29A基因的表达是由氯化钠和渗透胁迫诱导的，并编码一种在干燥过程中具有潜在保护功能的蛋白(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1993a，1993b)。PR1基因的表达是由SA和病原体攻击诱导的(Hammond-Kosack和Jones，1996)。因此，它可以被考虑到作为SA积累的分子标记。植物能够使用几种抗氧化酶去除ROS，如GPX(Rao和Davis，1999)。因此，GPX的表达可以作为氧化应激的分子标记物。

图 4.氯化钠仅在光下才能诱导脂质过氧化。TBARS含量的测定方法见“材料与方法”。所示的值是三个独立实验的平均值。野生型，白色条；NahG，黑色条。星号表示野生型和NahG之间的平均值存在显著差异(Plt;0.05)。误差条表示(n=50).

图5.氯化钠和SA对野生型和NahG中RD29A和PR1表达的影响。每道从野生型和NahG幼苗中装载10微克RNA。植物在Murashige和Skoog培养基中作为对照(MS)，用1m处理MSA，或用200米处理M氯化钠，如“材料和方法”中所述。

如图5所示，RD29A的表达可由氯化钠诱导，而SA也可适度诱导。在NahG植株中，RD29A是由氯化钠诱导的，这表明这种诱导不依赖于SA。SA而不是氯化钠诱导了野生型植物中PR1基因的表达。正如预期的那样，SA并不能在NahG植物中诱导PR1的表达，因为SA被积极降解为儿苯二酚。SA和氯化钠均增加了野生型植物中GPX的表达。有趣的是，氯化钠也诱导了NahG植株中GPX的表达，这表明氯化钠产生了一种独立于SA的氧化应激。这与氯化钠引起的NahG植物脂质过氧化作用增加相一致。

讨论

植物代谢的变化是渗透胁迫和盐引起的离子失衡的响应(Bohnertetal，1

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