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附录 A外文译文

外源茉莉酸能增强小麦幼苗对盐胁迫的耐受性

茉莉酸(JA)被认为是一种内源调节物质，在调节胁迫反应、植物生长发育中起着重要作用。为了研究外源茉莉酸缓解盐胁迫的生理机制，小麦幼苗叶面喷施2 mM茉莉酸3天，然后用150 mM NaCl处理。结果表明，与对照相比，150 mM NaCl处理显著降低了小麦幼苗的株高、根长、地上部干重、根干重、谷胱甘肽(GSH)、叶绿素b (Chl b)和类胡萝卜素(Car)的浓度、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性，提高了丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)的浓度和超氧自由基(O^2-)的产生速率。外源茉莉酸处理3天，通过降低MDA和H₂O₂浓度、O^2-产生速率，提高SOD、POD、CAT和APX的转录水平和活性以及GSH、chlb和Car的含量，显著增强了小麦幼苗对盐胁迫的耐受性，从而促进了盐胁迫幼苗的生长。这些结果表明，茉莉酸可以通过提高抗氧化酶活性和抗氧化物质浓度来抑制盐胁迫引起的过量活性氧，从而有效地保护小麦幼苗免受盐胁迫伤害，这对盐渍化土壤上的小麦栽培具有实际意义。

1 介绍

盐碱化是世界范围内严重限制作物生长和产量的主要环境因素之一，因为大多数作物对土壤中高浓度盐分引起的盐分敏感。盐胁迫可诱导多种形态、生理和代谢反应，引起渗透胁迫和活性氧(ROS)胁迫，导致脂质过氧化和抗氧化酶失活。ROS与多种分子相互作用，引起一系列反应，包括脂质过氧化、膜破坏、蛋白质变性和DNA突变。为了减轻和修复各种ROS引发的损伤，植物发展了一系列广泛的非酶和酶防御机制来解毒自由基，从而帮助保护自由基免受破坏性氧化应激。抗氧化防御系统包括谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)、alpha;-toco- pherol、脯氨酸和类胡萝卜素等非酶促抗氧化物质，而抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD, EC 1.15.1.1)、过氧化氢酶(CAT, EC 1.11.1.6)和过氧化物酶(POD, EC 1.11.1.7)。SOD是毒性O₂ ^{d -}自由基的主要清除剂，其酶的作用导致H₂O₂的形成，H₂O₂随后被酶过氧化物酶转化为H₂O。POD通过氧化酚类化合物或抗氧化剂等共底物分解H₂O₂，而CAT将H₂O₂分解为H₂O和O₂。大量证据表明，抗氧化系统在保护植物免受盐胁迫引起的氧化损伤方面发挥着重要作用。此外，大多数作物的耐盐性通常与更有效的氧化系统密切相关。因此，提高植物抗氧化酶活性和非酶促化合物含量是提高植物耐盐性的必要条件。

茉莉酸(Jasmonic acid, JA)及其甲酯茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)是天然存在的植物生长调节剂，调节植物的形态和生理生化过程。近年来，植物生长调节剂被认为是提高植物抗逆性、减轻胁迫损害、保证植物(作物)品质和产量的新途径。许多研究表明，茉莉酸在植物的非生物胁迫耐性中发挥着重要作用，茉莉酸因其对逆境胁迫下植物的保护作用而备受关注。外源1和2.5 mM JA可通过提高小麦幼苗的SOD活性、脯氨酸和花青素含量来抵消UV-B辐射的影响。Rezai et al.(2013)研究茉莉酸甲酯(MeJA)在缓解nacl诱导的辣椒盐胁迫中的作用，发现外源500 mg L - 1 MeJA可以通过增加叶绿素浓度、根系长度、地上部和根鲜重来提高辣椒幼苗对盐胁迫的抗性。然而，外源JA处理是否也能诱导小麦幼苗耐盐性尚不清楚。因此，外源JA处理可能通过调控小麦幼苗的生长、SOD、POD、CAT和APX的转录水平和活性、光合色素浓度、AsA、GSH和膜脂过氧化来提高小麦幼苗的耐盐性。

本研究旨在评价外源JA与盐胁迫的交互作用，在生理和分子水平上确定JA在小麦幼苗抗盐胁迫中的作用。本研究为研究外源JA对小麦幼苗盐胁迫响应的调节作用提供了新知识。

2 材料和方法

2.1 植物材料、生长及处理条件

统一的小麦种子(Triticum aestivum L. cv.)。用0.01% HgCl2表面消毒1 min，然后用流动的水冲洗几次。种子在直径为16厘米的培养皿中生长，每天用霍格兰溶液冲洗，在荧光灯提供的600 mu;mol m - 2 s - 1的光照下生长12小时，相对湿度为65%，温度为25℃/18℃(昼夜)。以1周龄(叶片完全展开)的幼苗为实验材料，分别用茉莉酸(JA)和NaCl处理。

处理：

1. 幼苗喷施含0.02的蒸馏水百分比(v / v)乙醇(控制,CK),接受150毫米，
2. 苗生理盐水含有0.02%乙醇(v / v)(氯化钠),
3. 秧苗喷洒2毫米JA仅含有0.02% (v / v)乙醇(JA),
4. 秧苗喷洒2毫米JA含有0.02%乙醇(v / v)之前额外的150毫米氯化钠(JAthorn;NaCl)。因为JA (Sigma-Aldrich)在水中的溶解度低，所以它被溶解在0.02% (v/v)的乙醇中，并用蒸馏水稀释。

对茉莉酸处理，2 mM茉莉酸(含0.02% (v/v)乙醇)喷施2次，每隔2天喷施2次，对照组则喷施等量的含0.02%乙醇的蒸馏水。JA处理开始后3天，在霍格兰溶液中加入150 mM NaCl，不论有无JA处理。Liu et al.(2012)选择了2 mM JA，他们报道外源1和2.5 mM JA可以通过增加小麦幼苗的抗氧化防御来抵消UV-B辐射的影响。以每组80株的5个培养皿为一组处理，所有实验均独立重复至少3次。盐胁迫4 d后，采集叶片，立即用液氮冷冻，- 70℃保存备用。在我们的初步实验中，我们发现，在盐胁迫下，外源JA对小麦幼苗的一些参数的影响在3-6天显著。因此，我们选择了盐胁迫第4天的数据。然后，另一株小麦幼苗的地上部和根部分别在105℃下孵育10分钟，并在65℃下置于热风烘箱中孵育至恒重，分别用电子秤称干重。同时测量了株高和根长。

2.2 测定丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)浓度及超氧自由基(O2 d -)生成速率

脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度由Predieri等人(1995)描述的硫代巴比妥酸(TBA)来评估。叶片样品(鲜重0.2 g, FW)用研钵和杵在50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)中均质，8000g离心15 min。取1 mL上清液与2.5 mL硫代巴比妥酸(TBA)在沸水中孵育30分钟，然后在冰浴中快速冷却。10000g离心5 min，在532和600 nm处检测上清液的吸光度。减去600 nm处的非特异性吸光度值。根据其摩尔消光系数(155 mM ^-1 cm ^-1)计算MDA浓度，用mmol MDA g ^{- 1} FW表示。

H2O2浓度是根据Shi et al.(2005)估算的。叶样品(0.5克鲜重,弗雷德里克)均质在冰浴3毫升的百分之三(w / v)三氯乙酸(TCA)和离心机在12000克15分钟。之后,1毫升的上层清液加入1毫升的100毫米磷酸钾缓冲(pH值7.0)和KI 2毫升的1米。在390 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算H2O2含量。用Elstner和Heupel(1976)改进的方法测定O2 d -的生成速率。鲜叶(0.1 g)用1 mL 50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)匀浆，10000 g离心10 min。将上清液(0.5 mL)与0.5 mL的65 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)和0.1 mL的10 mM羟胺氯水合物混合，然后在25℃孵育。1小时后，将混合物以25℃加入1 mL 17 mM磺胺和1 mL 7 mM alpha;-萘胺中20分钟。在530 nm处测定吸光度，根据NaNO₂的标准曲线计算出O₂^d-的生成速率。

2.3 抗氧化酶活性测定

在冷冻条件下，用研钵和杵将鲜叶(0.50 g)匀浆，加入3 mL磷酸盐缓冲液(50 mM, pH 7.8)，其中含有1 mM EDTA。1.5万g匀浆，4℃离心15分钟，所得上清用于酶检测。

SOD活性的测定采用Giannopolitis和Ries(1977)的方法，分光光度法测定在560 nm处氮蓝四唑(NBT)的光化学还原抑制作用。3 mL反应液由0.1 mL酶提取物、50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)、0.1 mM EDTA、130 mM蛋氨酸、0.75 mM NBT和0.02 mM核黄素组成。将反应管置于两盏40W荧光灯下启动反应，10分钟后将反应管从光源上取下终止反应。未照射和未上清液照射反应作为校准标准。SOD活性的一个单位被定义为引起NBT减少50%的抑制所需的酶量。在含有0.1 mL酶提取物、100 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、0.1 mu;M EDTA和0.1% H2O2的反应混合物中，在240 nm波长下分光光度法测定CAT活性。通过在240 nm处吸光度下降3 min来测定H2O2的分解，并通过其摩尔消光系数(39.4 mM ^-1 cm ^-1)来定量。CAT活性的一个单位定义为酶提取物引起的吸光度最小值- 1变化0.01 (Qiu et al.， 2011)。根据Zhang和Kirham(1994)的方法，以H₂O₂氧化愈创木酚为基础分析POD容量。将酶提液(20 mL)加入到含20 mL愈创木酚溶液和10 mL H₂O₂溶液的反应混合物中，加入3 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。酶提取物的加入启动了反应，在470 nm处记录了吸光度的增加，持续5 min。酶活性通过四角木醇的摩尔消光系数(26.6 mM ^-1 cm ^-1)来定量。

APX活性测定采用中野和Asada(1981)的方法。反应混合物(3 mL)包含0.1 mL酶提取物、50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.8)、0.1 mM EDTA、0.5 mM抗坏血酸和0.1 mM H₂O₂。APX被测定为在290 nm处抗坏血酸的吸光度下降，酶活性用2.8 mM ^-1 cm ^-1的摩尔消光系数进行定量。

2.4 非酶抗氧化剂和光合色素浓度的测定

应用Tonamura(1978)描述的方法来量化AsA的浓度。鲜叶(0.1 g)用2 mL 10%偏磷酸冷匀浆。15,000r离心10 min后，上清0.5 mL，加入1 mL柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 2.3)和1 mL 2,6 -二氯苯酚吲哚酚(30 mg L ^-1)。30 s后，在524 nm处测定吸光度，根据抗坏血酸标准曲线计算AsA含量。

鲜叶(0.1 g)用研钵和杵在冰水中5% (w/v)三氯乙酸中研磨，15,000g离心15 min。取上清液测定GSH含量。根据Ellman(1959)的方法测定还原性谷胱甘肽含量。上清(0.2 mL)加入2.6 mL NaH₂PO₄ (pH 7.7)和0.2 mL 5,5 -二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB,2.51 mg mL ^-1, pH 6.8)。30℃下5 min后，在412 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算还原性谷胱甘肽含量。

用10 mL 80%丙酮从幼苗叶片中提取光合色素，室温暗放24 h，提取液用分光光度法分析。叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)和类胡萝卜素(Car)含量分别根据Arnon(1949)和Lichtenthaler(1987)的方法估算。叶绿素a、b和Car分别在663、645和470 nm处吸收，浓度分别为mg g ^-1 FW。

2.5 总RNA提取及实时定量RT-PCR

根据制造商的协议，使用Concert Plant RNA Reagent (invitro)从不同处理的小麦幼苗中提取总RNA，并用无rnase的DNase I (Promega)处理。根据Qiu et al.(2013)的方法进行总RNA定量、cDNA合成和qRT-PCR。简单地说，根据制造商的说明，用随机六聚体和M-MLV逆转录酶(Promega)从2mg RNA合成第一链cDNA。采用SYBRs qPCR Mix (Toyobo, Japan)在20 mu;L的反应量中进行实时定量PCR，采用Rotor-Gene 3000实时PCR检测系统(Qiagen)进行3个重复反应。使用2 ^{-Delta;Delta;Ct}方法，结果是相对于每个样本中一个内参基因微管蛋白的表达水平表达的(Livak和Schmittgen, 2001)。利用SOD、POD、CAT、APX和内控微管蛋白等基因特异性引物，扩增小麦特异性扩增产物。引物序列和扩增子长度见支持信息表S1，它们是根据NCBI中可用的候选蛋白的小麦EST序列设计的。

2.6 统计分析

这个实验是一个完全随机的设计，有三个重复。形态学和生理特征数据进行双

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