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盐胁迫对菜豆的生长、叶绿素含量、脂质过氧化及抗氧化防御系统的影响

摘要

盐胁迫是影响植物细胞代谢和降低植物生产力的主要非生物胁迫之一。研究了盐胁迫下两种基因型菜豆抗氧化防御系统的变化。我们结果显示，基因型之间对盐胁迫反应的差异是一种数量性状，而不是质量性状，因为它们生长采取了相同的策略，合成和积累速率有显著不同，基于酚类化合物合成的抗氧化防御除外。对于2种基因型，盐胁迫导致根和茎干物质增益的显著降低以及氧化应激，如丙二醛含量的显著增加。此外，光合色素随着盐度的增加而减少。我们发现2种基因型在性质上只有一种差异，叶片中酚类化合物总生成量的减少，这种减少只在高浓度盐胁迫下的低产量基因型中可检测到。高产基因型可能有更好的保护措施来抵抗氧化损伤，通过在高浓度盐胁迫下增加抗氧化酶的活性以及总黄酮和抗坏血酸的量，这使得即使在胁迫条件下也能保持较高的产量。这些结果表明菜豆对盐胁迫诱导的氧化应激主要被酶防御系统抵消，以及酚类化合物的代谢是在非常极端的条件下诱导的。选择这一性状的基因型将在胁迫条件下提高产量。

1.介绍

盐胁迫是影响植物生长和代谢的主要因素之一，主要在干旱和半干旱地区导致严重的危害和生产力损失。将植物暴露于盐胁迫下会导致活性氧生成量增加(作为副产物)，从而损害细胞成分。活性氧引起叶绿素降解和膜脂过氧化，降低膜流动性和选择性。以脂质过氧化产物丙二醛含量测量来衡量叶绿素损失和脂质过氧化，被认为是氧化损伤的指标。

为了应对盐胁迫，植物已经发展出一系列酶（如过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和几种过氧化物酶）和非酶（抗坏血酸盐、类胡萝卜素、类黄酮和其它酚类化合物等。）解毒系统来抵消活性氧，并保护细胞免受氧化损伤。

已经报道过，抗氧化酶作为植物对盐胁迫响应机制的重要组成部分的作用，通过对过氧化物和H2O2的解毒。抗氧化剂如抗坏血酸和谷胱甘肽参与清除H2O2，同时参与的还有单脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶，从而再生抗坏血酸。在植物中类胡萝卜素是具有多种功能的色素，除了它们直接参与光合作用外，它们还参与氧化应激防御机制。在植物中酚类化合物还发挥多种作用，作为细胞壁的结构成分，调节生长和发育的过程，也参与抵御生物和非生物胁迫的机制。类黄酮代表主要和最复杂的多酚亚群，具有广泛的生物功能，包括抑制脂质过氧化。普通大豆（菜豆）是一种重要的、营养价值更大的蔬菜作物，在世界各地具有较高的消费和经济重要性。在世界各地菜豆主要生长在灌溉不良和部分含盐的条件下，它暴露在大量的盐胁迫下。尽管有许多证据支持抗氧化剂和抗氧化酶在盐度下的作用，但没有关于菜豆的具体信息。在这项研究中，我们假设增加的酶(过氧化氢酶，抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶)和非酶抗氧化剂(抗坏血酸、总类胡萝卜素、酚类物质和类黄酮)的活性有助于保护豆类植物抵抗盐胁迫。这项工作旨在评估盐胁迫对发展中国家广泛用于农业的两种豆类基因型的抗氧化反应、脂质膜过氧化和叶绿素含量的影响；高产lsquo;Temarsquo;和低产lsquo;Djadidarsquo;，为了更好地表征大豆对盐胁迫耐受性的响应，并确定有助于制定育种策略的限制因素，以提高盐胁迫下的产量。

1. 材料和方法

2.1植物材料

根据温室和田间观察显示生长和产量的差异，选择了阿尔及利亚普遍栽培的高产“Tema”和低产的“Djadida”两种基因型两种基因型。

2.2植物生长和处理

用5% (w/v)商业漂白剂次氯酸钠溶液(NaOCl)对豆种子表面消毒三次，每次30分钟，使用温和搅拌，随后在去离子水中洗涤，然后在25℃的黑暗中在湿纸巾之间催芽，用于以后选择均匀的幼苗。

7天后，将幼苗分别移植到含有商业泥炭和蛭石混合物(V:V)的花盆中，并置于温室中，控制光照强度约为600 mu;mol·m^minus;2·s^minus;1 ，光照时间为16 h，相对湿度为70%，昼夜温度为25/18°C。

幼苗用霍格兰营养液灌溉，每周两次到三次。在生长三周后，将每种基因型的植物分成四份处理，每份处理包含十株植物。通过在营养液中增加NaCl浓度(50、100和200 mM)，在三个处理上设置盐处理。对照处理用营养液持续灌溉。盐处理7天后，每种基因型取5株植物，并测定整株植物的鲜重和干重。将叶片样本保存在-80°C下以供进一步分析。

2.3光合色素

叶绿素(Chl a和Chl b)和总类胡萝卜素浓度采用分光光度法测定，使用100 mg FW磨碎的叶材料，置于预冷砂浆中，并加入8ml 80%(v/v)丙酮。完全提取后，过滤混合物，并用冷丙酮将体积调节至10 ml。在663.2、646.8和470 nm处读取提取物的吸光度，并根据Lichtenthaler方程计算色素浓度

2.4丙二醛

根据Heath和Packer，使用250 mg新鲜组织匀浆和5% (w/v)三氯乙酸(TBA)测定了丙二醛(MDA)，MDA通常用作膜脂质过氧化的指标，因此也是氧化应激损伤的极好标记。向1 mL等分上清液中加入4mL 0.5%(w/v)硫代巴比妥酸溶于20% (w/v)三氯乙酸。将混合物在95°C下加热30 min，迅速冷却，并在4°C下以10000 g离心10 min。读取532 nm处的上清液吸光度，并减去对应于非特异性吸收(600 nm)的值。脂质过氧化产物按TBA反应性物质的含量测定。MDA含量按155/(mM·cm)的摩尔消光系数计算。MDA含量以mu;mol·g-1 FW表示。

2.5组织离子浓度

使用研钵和杵将干燥的样品研磨成细粉。约100 mg在550°C的马弗炉中还原为灰烬5 h，然后使用加热块在60°C下用2ml 20% HCl(6N)消解5 min。将该热水提取物冷却，并用whatman 42号滤纸过滤，最后用去离子水稀释至50ml。使用原子吸收光谱仪(Perkins Elmer，Norwalk，CT，USA)测定Na 和K 浓度。

2.6抗氧化酶的提取和测定

根据Cakmak等人(1993)的方法，使用研钵从0.5 g叶组织中提取酶，并用5 ml含有50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.6)和0.1 mM Na2-EDTA的提取缓冲液压片。将匀浆在4℃下以15000 g离心15分钟，上清液部分用于测定各种酶。在含有25 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、10 mM H2O2和酶的反应混合物中测定过氧化氢酶活性(CAT)。H2O2在240 nm处分解(E = 39.4mM cm-1)。抗坏血酸过氧化物酶活性(APX)通过测量氧化抗坏血酸在290 nm处的吸光度下降来确定。一单位APX被定义为消耗1 mu;mol抗坏血酸盐min-1所需的酶量。谷胱甘肽还原酶活性(GR)通过在340 nm下的吸光度测量NADPH的酶依赖性氧化来确定。GR活性的一个单位被定义为氧化1 mu;mol NADPH min-1的酶的量。

2.7非酶抗氧化剂

根据Blainski等人(2013年)的说法，通过与Folin-Ciocalteu试剂反应来定量总酚类化合物。在765 nm处测量吸光度，结果以没食子酸当量(mg eq.GA G1 DW)，用作标准溶液。按照Zhishen等人(1999)描述的方法测定类黄酮含量；在510 nm测量吸光度，以儿茶素的当量表示类黄酮的量(mg eq.c g-1 DW)，用作标准溶液。使用Luwe等人(1993年)稍加修改的方法估计抗坏血酸(ASC)浓度。将植物样本(0.5 g)在液氮研钵中研磨，然后在冰冷的三氯乙酸(TCA，1% w/v)中匀浆。然后在4°C下以12000 g离心匀浆20 min，并将上清液(50 mu;L)与磷酸钾缓冲液(0.95 mL，100 mM，pH 7.0)和抗坏血酸氧化酶(1 mu;L，单位为1mu;L-1)混合。然后在265 nm下记录AsA氧化(E = 14.3mM·cm-1)。

2.8统计分析

分析前，采用Levene检验检查ANOVA要求。采用95%置信水平，单因素方差分析评估治疗之间差异的显著性。当比较两个以上样本时，使用事后Tukey检验估计同质组。

3结果

3.1生长

盐胁迫对于两种基因型植物的地上部和根部生物量都有不利影响（值小于0.01）。独立于盐度，高产基因型Tema的地上部生物量较高。随着生长培养基中盐胁迫浓度的增加，地上部干重逐渐降低。在200 mM NaCl条件下，高产基因型Tema的下降幅度约为30%，低产基因型Djadida的下降幅度约为27%。与各自对照组相比，在高盐度条件下，Tema和Djadida的根干重分别下降了59%和61%（图1）。

3.2光合色素

结果表明，盐浓度与光合色素含量呈负相关。与对照相比，在高浓度盐胁迫条件下，当生长培养基中NaCl浓度增加时，高产基因型Tema的叶绿素 a含量下降到52%，低产基因型Djadida下降到57%。此外，高产基因型Tema的叶绿素 b含量下降到33%，而低产基因型Djadida下降到43%。高产基因型Tema的总类胡萝卜素含量下降18%，低产基因型Djadida下降19%（图2）。

3.3脂质过氧化

在所有处理中，高产基因型Djadida的丙二醛累积率较高，表明脂质过氧化和氧化损伤率较高。NaCl处理导致两种基因型的丙二醛水平逐渐升高。高浓度盐胁迫导致Tema和Djadida的丙二醛水平分别升高44%和56%（图2）

3.4叶片离子含量

叶片是植物与大气接触的最后一个库和最敏感的部分，也是盐积累的地方，主要在细胞液泡中。对照处理下，高产基因型Tema的叶片中Na 含量较高。NaCl处理显著影响两种基因型的Na 和K 含量(p-值小于0.001)。与对照植物相比，高浓度盐使高产基因型Tema的叶片Na 浓度急剧增加到5倍，低产基因型Djadida增加到7倍。然而，随着NaCl处理，高产基因型Tema的K 浓度下降约32%，低产基因型Djadida下降35%(图3)。因此，当植物受到盐胁迫时，K /Na 比值显著下降，但在高产基因型Tema中观察到较高的值。

3.5抗氧化酶活性

随着生长培养基中NaCl浓度的增加，两种基因型的过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性均显著增加(p值小于0.001)。随着NaCl浓度的增加，两种基因型的抗氧化酶活性存在显著差异。除了在100 mM NaCl处理下Djadida基因型的酶活性较高的APX活性之外，所有处理下高产基因型Tema的酶活性均较高。两种基因型在对照处理下显示出几乎相似的抗氧化酶活性。然而，在高浓度盐条件下，估计Tema基因型的GR活性增加率约为60%，Djadida基因型约为20%。同样，CAT活性在高产基因型Tema中增加了4倍，在低产基因型Djadida中增加了2倍。此外，在相同条件下，APX活性在Tema增加了7倍，在Djadida增加了6倍(图4)。

3.6非酶抗氧化剂

高产基因型Tema在所有处理下均表现出较高的抗坏血酸、总黄酮和酚类化合物含量(p值小于 0.05).盐胁迫下，两种基因型抗坏血酸和总黄酮含量均显著增加(p值小于0.01)，但程度不同。在高盐度下，高产基因型Tema的抗坏血酸和总黄酮的增加率分别为33%和47%，而低产基因型Djadida的增加率分别为26%和70%。在盐胁迫下，高产基因型Tema的总酚含量没有显著变化。仅在200 mM NaCl (p-值小于0.05)条件下，Djadida的总酚含量显著下降(图4)。

图1。盐胁迫下两种基因型菜豆的茎干重(SDW)和根干重(RDW)。根据Tukey检验(alpha; = 0.05)，不同的小写字母表示相同基因型的治疗之间存在显著差异；星号表示每种处理的两种基因型之间的显著差异。

图2。盐度胁迫下两种基因型菜豆的叶绿素a (Chl a)、叶绿素b (Chl b)、总类胡萝卜素(Car)含量和脂质过氧化(TBARS)。根据Tukey检验(alpha; = 0.05)，不同的小写字母表示相同基因型的治疗之间存在显著差异；星号表示每种处理的两种基因型之间的显著差异。

4讨论

盐胁迫是阻止作物获得其全部遗传潜力的主要环境因素，因此，豆类中的盐胁迫诱导几个生长限制。豆类植物能够在低于50 mM NaCl的盐度水平下正常生长，但在较高盐浓度下，两种基因型的生物量均大幅下降。就干重而言，发现两种基因型对盐度的反应不同。高产基因型Tema表现出比低产基因型Djadida更好的生长。在盐条件下植物生长和干物质积累的减少已在包括普通豆类在内的几种谷类豆类中有报道。生长迟缓可归因于细胞伸长的抑制。

我们的结果表明，盐胁迫下叶绿素a和叶绿素b显著下降，这与Turan等人(2007年)对普通菜豆和Taffouo等人(2010年)对豇豆的研究结果一致。盐胁迫植物中叶绿素水平的下降被认为是氧化胁迫的典型症状，其原因是叶绿素合成受到抑制，同时叶绿素酶激活了叶绿素的降解。由于缓慢合成或快速分解导致的叶绿素含量降低表明，存在通过降低叶绿素含量来降低光吸收率的光保护机制。

作为抗氧化剂，类胡萝卜素有可能使植物免受活性氧的影响。盐度诱导两种基因型类胡萝卜素含量的下降。这些结果与Gadallah (1999年)和Singh等人(2008年)在玉米和小麦基因型中发现的结果一致。已知类胡萝卜素作为光合作用的光能收集器和三重态叶绿素和O2的淬灭剂。此外，它们通过叶黄素循环耗散多余的能量，并可作为强大的叶绿体膜稳定剂，在集光复合体(LHC)和类囊体膜的脂质相之间分配，降低膜流动性和对脂质过氧化的敏感性。类胡萝卜素含量的降低表明类胡萝卜素的保护不是盐胁迫下最重要的机制之一。

在盐胁迫下，离子转运和含量会发生改变。不同植物采用不同策略应对Na 的毒性；一些植物将钠转运到叶片并在液泡中积累，而另一些植物在根部水平挤压钠。增加钾的吸收也是一种已知的对抗钠进入的策略。盐胁迫下

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