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氧化铁纳米颗粒可以改善小麦植株的镉胁迫和盐胁迫，促进光合色素的生成，限制镉的吸收

摘 要

镉和盐度是全球环境资源和农业实践的主要威胁。本工作旨在绿色合成、表征和应用氧化铁纳米颗粒以共同缓解小麦植物中的镉和盐胁迫。氧化铁NPs由天然细菌菌株Pantoea ananatis菌株RNT4合成，通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像证明其尺寸范围为19至40nm的球形FeO-NPs。结果表明，在原始盐渍土中施用100mg/kg的生物工程化FeO-NPs，通过减轻非生物胁迫的不利影响并由此重新编程小麦植物的形态生理状态，刺激了小麦植物的生长，与对照组相比，增加了36.7%的长度。此外，土壤中FeO-NPs的存在显著增加了N、P和K 的养分浓度，同时减少了小麦籽粒中的Na 和Cl^-成分。有趣的是，在Cd污染的土壤中施用FeO-NPs最终使小麦植物对Cd的吸收减少了72.5%，这可能是由于Cd吸附到NPs的大表面上，从而限制了植物对Cd的生物利用度。这首次证明了以FeO-NPs为基础的处理可作为一种缓解镉污染盐渍土壤中的Cd和盐胁迫的候选农业策略，从而实现安全的农业实践。

关键词 抗氧化剂酶；绿色纳米粒子；重金属；盐胁迫

第1章 绪论

小麦（Triticum aestivum L.）是人类消费的最重要的食用谷物之一，是全球第二大种植谷物和产量，年产量为7.13亿吨（Lu等人，2020年）。巴基斯坦以2423万吨的年总产量位居前10位小麦生产国之列，而中国以约2400万公顷的小麦耕地面积位居榜首（Noman等人，2020年a；Jin等人，2013年）。另一方面，不断增加的粮食需求（主要归功于世界人口的增长）引发了集约化农业实践，例如极端施肥，最终导致土壤恶化和潜在的生态灾害，很大程度上阻碍了小麦生产（Yadav等人，2010年；Joshi等人，2007年）。此外，世界人口增长还刺激了采矿和工业化等人为活动的显着增加，造成了严重的环境污染。因此，作物保护措施改变了耕地的质量和稳定性，威胁到可持续作物种植的土地稳定性（Shakya和Agarwal，2020年）。

重金属是主要的环境污染物，通过可食部分的有害元素积累对谷类作物造成严重威胁（Ashraf等人，2019年；Wu等人，2019年）。土壤中常见的重金属有镉（Cd）、镍（Ni）、砷（As）、铬（Cr）、锌（Zn）和铅（Pb）等（Goyal等人，2020；Rahman和Singh，2019）。在这些重金属中，镉是一种环境污染物，因为它对植物和人类健康具有毒性（Hussain等人，2020年；Noman等人，2020年a；Gruuml;ter等人，2019年）。镉的积累会限制植物生长，并增加植物中活性氧（ROS）的产生，最终导致细胞氧化损伤和抑制植物的光合作用、离子调节和养分吸收（AlMahmud等人，2019；Huybrechts等人，2020年；Li等人，2020年）。土壤盐分是对全球小麦生产的另一个主要威胁（Shahid等人，2019年；Zafar-ul-Hye等人，2019年）。大量研究表明，盐分胁迫可能会增加植物的迁移率，从而增加对Cd的吸收，从而对更大的金属毒性产生重大影响（Rady，2011年；Rady等人，2019年；Shafi等人，2010年；Ahmed等人，2021年）。据报道，由于Cd易位和随之而来的小麦植物中的积累，盐和Cd的联合胁迫可能会降低叶绿素浓度，同时增加ROS的产生（Shafi等人，2009年）。在最近的一项研究中，Abbas等人。（2018年b）发现高浓度的NaCl会增加生长在Cd污染和盐渍土壤上的不同小麦植物组织中的Cd浓度。人们普遍担心，共同减轻植物-土壤系统中的盐分和镉毒性是可持续农业面临的一项重大挑战。已经尝试了许多努力来抵消植物中Cd和盐胁迫的毒性（Gruuml;ter等人，2017年；Abbas等人，2018年b）。

纳米技术最近已成为解决农业问题的一种环境友好型方法（Ahmed等人，2020年a；Singh等人，2016年）。它已被公认为能够通过增强植物养分吸收和抗病性来促进作物生产（Iavicoli等人，2017年），因此在可持续农业方面具有巨大潜力。在纳米粒子中，氧化铁纳米粒子（FeO-NPs）由于其性质稳定和独特的物理化学性质，可能成为植物生长的潜在剂。在植物中，Fe参与各种生理过程，包括氧化还原反应、呼吸作用和叶绿素生物合成（Rui等人，2016）。此外，FeO-NPs的大表面积可作为平台来减少养分损失并及时向植物输送（Wang等人，2016年）。最近，FeO-NPs已直接用于促进植物生长和修复重金属和干旱胁迫（Adrees等人，2020；Hussain等人，2019年）。

许多物理和化学方法已用于金属纳米粒子的合成；然而，物理和化学方法都会导致环境污染和毒性（Shnoudeh等人，2019年）。另一方面，研究表明，化学合成的NPs的应用可能会产生毒性影响，延缓植物生长和交替的土壤微生物群落（Falco等人，2020年；Rajput等人，2018年）。例如，据报道化学合成的银纳米粒子对水稻植物的植物毒性作用，与对照处理相比，植物生长显着降低（Thuesombat等人，2014年）。Lee等人的一项研究。（2008年）揭示了铜NPs对小麦和绿豆植物生长的不利影响。Bandyopadhyay等人（2012年）发现化学合成的氧化锌NPs对土壤微生物有毒，例如苜蓿中华根瘤菌，它负责固氮。发现通常使用绿色合成的新兴生物方法对环境友好且毒性较小，并且具有成本效益优势，已引起对可持续商业可行性的广泛关注（Ahmed等人，2017年；Kasote等人，2019年；Saif等人，2016年）。生物合成NPs的一些开创性实施已经显示出显着影响，例如减少重金属向植物地上部分的吸收和转移（Sun等人，2019年），或对金属污染土壤的复垦（Hussain等人，2019年；Noman等人，2020年b）。例如，各种研究表明，FeO-NPs可能会显着降低电解液泄漏（EL）、丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）浓度，同时增加Cd胁迫下植物中抗氧化剂的活性（Elanchezhian等人，2017年；Gong等人，2017年）。同样，Konate等人（2017年）还发现，FeO-NPs的应用明显刺激了Cd胁迫下小麦幼苗的生长。有证据表明，氧化锌纳米粒子会减少重金属的吸收并减轻它们在小麦植物中的毒性（Rizwan等人，2019年b），而硅纳米粒子可能会延缓Cd在作物中的积累，从而提高小麦植物的生物量（Ali等人，2019年）。Soliman等人的一项研究（2015年）表明氧化铁和氧化锌NPs具有改善盐胁迫条件下生长的辣木植物的抗氧化特性和养分吸收的潜力。

文献中尚未报道绿色FeO-NPs在共同改善植物中Cd和盐分的毒性作用方面的作用。因此，需要在该领域进行广泛的研究，以启发FeO-NPs与Cd污染盐渍土壤中植物的相互作用。目前的研究推测，FeO-NPs可以通过缓解细胞氧化应激和促进光合色素以及减少镉易位来减轻小麦植株中镉和盐分胁迫的组合毒性。因此，当前研究的目的是研究生物合成的FeO-NPs对减轻小麦植物免受盐分和Cd双重胁迫的改善作用。

第2章 材料和方法

2.1 菌株RNT4的分离、分子鉴定和系统发育分析

菌株Pantoea ananatis RNT4根据Somasegaran和Hoben（1994年）采用连续稀释法从小麦根际中分离得到。为了分离，将1克土壤样品添加到9mL盐水溶液（0.85%NaCl，w/v）中，并使用涡旋混合物（Vortex QL-861）连续稀释。将更高的稀释度（10^-5和10^-7）涂抹（100mu;L）在用5%（w/v）NaCl修正的营养琼脂板上。将平板在28plusmn;2℃下培养24小时以进行菌落生长。然后通过在琼脂培养基上重复划线（3-4次）来纯化细菌培养物。

对于细菌菌株的分类鉴定，使用CTAB方法（Wilson，2001年）分离基因组DNA。根据Weisburg等人（1991年）分离的菌株DNA用作模板，通过通用引物（fD1和rD1）扩增16SrRNA基因。扩增的16SrRNA基因产物测序来自中国青客，采用Sanger法进行。NCBI在线程序、BLASTn、EzBioCloud服务器和核糖体数据库项目（RDP）的SEQMATCH工具用于RNT4序列相似性分析的16S rRNA基因。将RNT4菌株的16S rRNA基因与典型菌株和紧密匹配的GenBank分离株进行序列比对推断系统发育分析，并利用MEGA7软件包通过最大似然法（ML法）构建系统发育树。为获取入藏号，最终序列提交至NCBI bankit。

2.2 FeO-NPs的生物合成和表征

根据Fatemi等人（2018年）的方法，使用RNT4菌株进行FeO-NPs的细胞外生物合成。具体来说，RNT4菌株在28plusmn;2℃和170rpm的振动培养箱中用肉汤（NB）培养基培养24小时。之后，在6000转离心10分钟后获得上清液。对于FeO-NPs的生物合成，将50mLRNT4培养上清液加入到250mL锥形瓶中等体积的5mM FeCl₃·6H₂O溶液中。反应混合物在28plusmn;2℃和170rpm24小时。在颜色从淡黄色变为混浊棕色后，使用10000转离心15分钟收集产生的FeO-NPs。收获的颗粒用无水乙醇洗涤两次，然后在ALPHA 1-2/LD-Plus真空中冷冻干燥以获得纯化的FeO-NPs。此外，使用紫外-可见分光光度计（Shimadzu，Kyoto，Japan）在200-800nm的波长范围内检查了FeO-NPs的形成。根据Seifan等人（2018年）在4000-400cm^-1的波长范围内，使用FTIR光谱（Vector 22，Bruker，Germany）鉴定了FeO-NPs样品的官能团。X射线衍射（XRD，XPert PRO diffractometer，Holland）分析在45kV的检测器电压和40Ma的电流下进行，以表征FeO-NPs的晶体结构（Mukherjee等人，2010年）。进行SEM（SU8010，Hitachi，Japan）和TEM（1230-JEOL，Akishima，Japan）分析以确定FeO-NPs的尺寸和形状（Behera等人，2012年）。能量色散光谱（EDS）（Oxford-Instruments，UK）用于表征20keV下FeO-NPs的元素组成和金属分数。

2.3 盆栽实验

2.3.1 植物材料和实验设计

实验土壤是从位于巴基斯坦旁遮普省Pakka Anna（31°1355'N和72°480'E）附近的富含盐的田地收集的。它由400公顷的盐碱地组成，几十年来一直荒芜。实验土壤用灭菌的聚乙烯袋运送到巴基斯坦旁遮普省费萨拉巴德市政府学院大学的温室。在进一步分析之前，将土壤样品风干并过2毫米筛分。根据Bouyoucos（1962年）使用比重计测量土壤质地。土壤物理和化学参数的测定方法如之前Walkley和Black（1934）所述的方法。土壤理化性质见表1。

土壤电导率（EC）和pH值高，有机质浓度低，速效N、P、K贫乏。与作为Cd源的硝酸镉[Cd（NO₃）₂]（4.75mg/kg）混合，然后在室温下孵育一个月以使金属稳定，然后根据Irfan等人（2013年）进行盆栽实验。之后，将实验盆中的盐和镉影响的土壤（每盆1kg土壤）填充。小麦种子（var.Galaxy）用次氯酸钠（4%，w/v）消毒15分钟，然后用蒸馏水轻轻冲洗以去除残留的氯化物。播种后（8粒种子/盆），将三种不同水平的FeO-NPs（25、50和100mg/kg土壤）混合在蒸馏水中，并在盆中提供给土壤。用不含FeO-NPs的蒸馏水灌溉的花盆作为对照处理。发芽后15天将幼苗间苗至每盆5株。每隔一天用半强度的Hoagland溶液交替灌溉花盆60天。实验在温室（昼夜温度25–28℃和16/8光照/黑暗时段）中进行，完全随机设计（CRD）。每个处理重复四次。

2.3.2 估计植物生长和生理参数

在移植后60天通过将整株植物连根连根来收获植物。测量每株植物的生长参数，包括株高、植物鲜重和干重，并取每盆的平均值。根据Heath和Packer（1968年）的方法，通过硫代巴比妥酸（TBA）反应测定叶片MDA浓度，作为脂质过氧化的量度。根据Kingston-Smith等人（1999年）估计叶片中的H2O2浓度。将叶子样品（0.25g）在10mL0.1%三氯乙酸（TCA）中研磨，并以12000g离心15分钟。然后，将1mL萃取溶液加入5mL含20%TCA的0.5%硫代巴比妥酸（TBA）中，然后在95℃下加热30分钟。冷却后，将混合物再次以12000g离心15分钟，并使用紫外可见分光光度计（Hitachi U-2910，Japan）记录上清液在532nm处MDA和410nm处H₂O₂浓度的吸光度。使用已知浓度的H₂O₂构建的标准曲线计算H2O2浓度。根据Dionisio-Sese和Tobita（1998年）修改的方法对完整小麦叶片中的电解质泄漏（EL）进行量化。详细地说，叶子样品在管中用去离子水在30℃下孵育。孵育4小时后收集溶液并冷却至室温以进行EC1测量。在收集用于EC2分析的溶液之前，在121℃下再孵育30分钟。EL是EC

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