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纤维素酶在新型介孔金属有机框架中的原位封装

作者: Xuesong Zhang，Suhua Zheng，Juan Tao，Xiaoji Wang

出处: 施普林格科学 商业媒体有限责任公司，施普林格自然2021

摘要: 传统的金属有机框架（MOFs）中的纤维素酶的原位封装受到苛刻的制备条件和相当小的框架孔隙的限制。在此，我们开发了一种在温和条件下制备的介孔锌基MOF（Zn-mIm），非常适合于纤维素酶的原位封装。简而言之，纤维素酶通过纤维素酶和Zn-mIm前体的共沉淀而被封装，被称为纤维素酶@Zn-mIm。这种方法增强了纤维素酶和Zn-mIm之间的结合。纤维素酶的装载量也明显增加，最高装载量可达350毫克/克。此外，纤维素酶@Zn-mIm对碱性环境表现出卓越的耐受性，在pH值为8的情况下能保持65%的活性，而自由纤维素酶的活性只下降到10%。纤维素酶@Zn-mIm还表现出良好的可回收性，在四个循环后可保留77%的活性。此外，在Zn-mIm的制备过程中，纤维素酶的引入导致了结构缺陷，从而形成了大的孔隙，这有利于质量传递，从而提高了酶的效率。

图文摘要:

关键词: 纤维素；原位封装；金属有机框架

1. 引言

由于纤维素酶的反应速度快、反应条件温和、选择性强，最近人们对纤维素的酶促转化越来越关注[1-3]。然而，由于工业过程中的苛刻条件，需要纤维素酶的稳定性和可回收性[4, 5]。酶的固定化技术提供了一个有效的手段来简化回收过程并提高操作的稳定性[6-9]。各种材料已被建议作为酶的支持物，如树脂、凝胶、纤维、无机多孔材料和其他一些材料[10-12]。尽管它们具有来源广泛、成本低和稳定性好的优点，但大多数材料的生物活性较低，这导致了酶的浸出和酶活性的降低。因此，支撑物的生物相容性是纤维素酶固定化的一个紧迫问题。

金属有机框架材料（MOFs）是一种新型的有机-无机混合结晶多孔材料，具有高孔隙率、大比表面积、孔径可调和良好的生物相容性[13, 14]。目前，MOFs的应用主要集中在储氢、气体吸附和分离、生物传感器、药物输送等领域[15-20]。现在，MOFs是作为纤维素酶固定化的支撑物的首选。由于其均匀的结晶结构，MOFs表现出高的蛋白质负载和稳定性[21]。Ahmed等人[22]将纤维素酶固定在氨基功能化的MOFs上，以提高纤维素酶在纤维素水解过程中的稳定性。固定化的纤维素酶对温度和pH值的耐受性明显提高。Qi等人[23]制备了磁性纳米MOFs作为支撑物，通过戊二醛交联固定纤维素酶。与游离纤维素酶相比，固定化纤维素酶在5g /L的甲酸和21.5%的香兰素中的活性增加了16.8%。

尽管MOFs是固定纤维素酶的优秀支撑材料，但常用的固定化方法主要是可逆的物理吸附或共价吸附/交联[23-25]。由于MOFs的微孔结构，纤维素酶只能通过上述固定化方法固定在MOFs的外表面，所以MOFs的多孔性并没有被完全利用[26, 27]。此外，它们的微孔性质限制了大分子底物的运输。原位封装是将纤维素酶嵌入到MOFs内部的一种可取的方法[28, 29]。它增加了纤维素酶的负荷，并显著增强了纤维素酶的结合，从而最大限度地减少了纤维素酶的浸出。然而，大多数MOFs有苛刻的预处理条件[30-32]，不利于通过原位封装使纤维素酶成像。Zeolitic imida- zolate framework-8（ZIF-8）目前被广泛用于封装酶，因为它可以在生物相容性条件下合成[33]。而ZIF-8也被称为微孔MOF，其平均孔径为2.3nm[34]，ZIF-8的小孔径会阻止大分子纤维素的扩散，从而无法进入被包覆的纤维素酶。目前的挑战是如何在温和的制备条件下实现具有大孔径的MOF。

在此，我们描述了在室温和温和的pH值下合成介孔Zn-基MOF（Zn-mIm）作为酶的支持。纤维素酶首先被原位封装在Zn-mIm中，形成纤维素酶@Zn-mIm。本研究对纤维素酶@Zn-mIm的形态进行了表征。通过测试纤维素酶的负载量、对酸碱条件的耐受性、热稳定性和可回收性，也评估了封装的影响。这项工作的目的是在MOFs中完成纤维素酶的原位封装，以提高其稳定性。

2. 材料和方法

纤维素酶（黑曲霉）购自TCI（上海）发展有限公司。(Shanghai, China)。2-甲基咪唑、乙酸锌、羧甲基纤维素钠和Coomassie亮蓝G-250购自萨安化学技术（上海）有限公司。(Shanghai, China).所有的化学品都没有经过提纯就被使用。

2.1 Zn-Im的合成

将2-甲基咪唑（1.968克）溶于150毫升的去离子水，形成有机配体溶液。将乙酸锌（2.634克）溶于150毫升去离子水，形成金属离子溶液。在室温下，在磁力搅拌下将金属离子溶液滴入有机配体溶液中。沉淀立即形成，再轻轻搅拌12小时。复合体被过滤，用去离子水洗涤三次以去除未反应的分子。纯化后，复合材料（Zn-Im）在真空下冷冻干燥。

2.2 固定化纤维素酶的合成

纤维素酶@Zn-mIm是通过原位封装法制备的。该制备方法是基于Zn-mIm的方法，但做了如下修改。将2-甲基咪唑溶解在磷酸盐缓冲液（pH4.8，0.1M）中，并将一定比例的纤维素酶分散在有机配体溶液中。之后，纤维素酶@Zn-mIm的制备方法与上述Zn-mIm的制备方法相同。干燥的纤维素酶@Zn-mIm在使用前被储存在4℃ 的冰箱中。

相反，通过物理吸附固定在Zn-mIm上的纤维素酶也被制备出来，被确定为cel- lulase-on-Zn-mIm。将Zn-Im（600毫克）与150毫升2毫克/毫升的纤维素酶磷酸盐缓冲溶液（pH4.8，0.1M）混合，并在室温下缓慢搅拌12小时。将复合物过滤，用去离子水洗三次，以去除未固定的纤维素酶。最后，在真空下对复合物进行冷冻干燥。

2.3 纤维素酶装载能力的测定

使用Bio-Rad蛋白质分析程序（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）来测量一系列纤维素酶的浓度，以获得标准曲线[35]。将纤维素酶溶液加入库马西亮蓝G-250试剂中，然后测量吸光度，通过与标准曲线的比较获得纤维素酶浓度。固定化纤维素酶的负载能力用以下公式计算。

纤维素酶装载量(mg /g) =(M₀-M₁)/M

其中M₀是最初引入固定化溶液中的纤维素酶的质量（mg）；M₁是未固定的纤维素酶的质量，它在固定化后的上清液和三次洗涤液中被溶解（mg）；M是支撑物的质量（g）。

2.4 纤维素酶活性的测定

以羧甲基纤维素钠为底物，用国际纯粹与应用化学单位（IUPAC）的方法测定纤维素酶的活性[36]。将蛋白含量为14mu;g的游离或固定化纤维素酶溶解在0.5mL醋酸缓冲液（50mM，pH4.8）中，然后与2mL羧甲基纤维素钠（1%于50mM醋酸缓冲液，pH4.8）混合。反应在摇瓶中于40℃下进行30分钟，然后加入3mL 3,5-二硝基水杨酸作为发色剂。将反应在沸水中加热5分钟后熄灭。葡萄糖的量是用紫外分光光度法（UV-5200PC，上海美塔什仪器有限公司，上海，中国）在540nm波长下测量的。在本文中，所有报道的纤维素酶的活性都是在最佳条件下（40℃，pH4.5或50℃，pH4.8），分别以相对于游离或固定化细胞酶的活性计算的。

固定化纤维素酶的活性恢复是通过以下公式计算的[37]。

活性恢复（%）= （固定化纤维素酶的活性/游离纤维素酶的活性）*100%

2.5 回收试验

纤维素酶@Zn-mIm和纤维素酶-Zn-mIm的回收试验以类似于活性测定部分的方式进行；不同的是，在酶促反应后，混合物未经灭活直接过滤。沉淀物用乙酸盐缓冲液（50mM，pH4.8）洗涤三次以去除可溶性残留物，然后在真空下冷冻干燥24小时。以初始反应的活性为标准，计算相对活性。

2.6 X射线衍射（XRD）

Zn-mIm和纤维素酶@Zn-mIm的X射线衍射特性由D8ADNANCE X射线衍射仪（German bruker Axs Gmbh, Karlsruhe, Germany）表征，以Cu-kalpha;（lambda;=0.145 nm）为辐射源，在5°-50°范围内，扫描速率为4° min^-1，确认晶体结构。

2.7 扫描电子显微镜(SEM)

使用日立S-4800扫描电子显微镜（Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan），在6千伏的电压下，用SEM对形态和元素图谱进行了表征。

2.8 氮吸附/解吸等温线

Zn-mIm和纤维素酶@ Zn-mIm的孔隙分布、孔隙体积和Bruner-Emmet- Teller（BET）比表面积通过Quantachrome Autosorb -IQASIQ物理吸附（Quantachrome Instruments, Florida, USA）进行表征，并使用非局部密度函数理论方法进行计算。氮的吸附和解吸等温线是在77K条件下测定的。在氮气物理吸附之前，样品在200℃下脱气10小时。

3. 结果和讨论

3.1 纤维素酶@ Zn-mIm的制备和表征

纤维素酶在MOFs中的封装增强了纤维素酶与MOFs之间的结合，从而最大限度地减少了纤维素酶的浸出。然而，大多数MOFs的制备条件很苛刻，如高温、极端的酸性或碱性环境或不相容的有机试剂，这将导致纤维素酶在原位包埋方法中失活。在这项研究中，我们选择了相对不活跃的2-甲基咪唑作为有机配体，在室温和可接受的pH值下合成了一种新的Zn基MOF；得到的MOF被命名为Zn-Im。Zn-mIm的结构如图1所示。Zn-Im的晶体为三棱柱系统，空间群为P3221。Zn² 离子被Im配体的四个N原子配位，导致了四边形的配位几何。

图1.Zn-mIm的结构示意图，b模拟模型（Zn原子显示为橙色或黄色，N原子为蓝色，C原子为灰色）。

一个Im配体与两个Zn² 离子协调，角度分别为108.77°和104.88°。因此，ZnN4的四边形配位几何是一个扭曲的四面体。由Im配体连接的Zn² 离子形成了一个三维网络。在SEM图像中（图2），Zn-Im被显示为具有椭圆形和分层结构。Zn-Im的模拟结构与SEM的测量结果很一致。孔径分布结果（图3）显示，Zn-Im是一种介孔MOF，主要孔径为5.01nm。根据孔径分布曲线，在12.68 nm、16.14 nm和25.24 nm的孔径处也有三个峰值，表明这三种孔径在Zn-Im中占有重要比例。鉴于反应条件温和，孔径分布较广，Zn-Im被认为是封装纤维素酶的合适载体。通过纤维素酶、锌离子和2-甲基咪唑在Zn-mIm形成过程中的共沉淀，纤维素酶被原位封装在Zn-mIm中，并被确认为纤维素酶@ Zn-mIm。由于包裹的纤维素酶占据了Zn-mIm的孔隙，纤维素酶@ Zn-mIm的主要孔隙尺寸变得略小，为3.16纳米和4.54纳米（图3）。值得注意的是，在Zn-mIm的制备过程中，纤维素酶的引入造成了结构缺陷，导致了具有较大孔径的介孔MOFs的形成。与Zn-Im相比，纤维素酶@Zn-Im在28.75纳米和36纳米的孔径上有相当大的比例。图4所示的氮气吸收-解吸等温线显示，吸附曲线在中压（P/P₀=0.3-0.8）范围内缓慢上升，在高压（P/P₀=0.8-1.0）下急剧上升，这也表明纤维素酶@Zn-Im的介孔结构。大孔径允许大分子纤维素的扩散，减少了传质阻力，从而增强了纤维素的酶促反应。值得注意的是，纤维素酶@Zn- mIm的BET比表面积（26.15 m² g^-1）与Zn-mIm晶体（27.98 m² g^-1）相比略有下降。这说明封装的纤维素酶被Zn-Im所包围，表面积略有减少。尽管纤维素酶占据了Zn-mIm内部孔隙的空间，但纤维素酶@Zn-mIm的孔隙体积减少了20%（纤维素酶@Zn-mIm：0.078 cm³ g^-1，Zn-mIm：0.099 cm³ g^-1）。

纤维素酶@Zn-mIm的结构是通过XRD检查的。如图5所示，由于包裹的纤维素酶引起的纬向变形，纤维素酶@Zn-mIm的峰值向高角度移动。然而，纤维素酶@Zn-mIm的XRD图案与Zn-mIm相同，证实了Zn-mIm的晶体结构在纤维素酶封装后被保留下来。此外，实验材料的XRD图样与Zn-mIm模拟图样对应良好，进一步表明Zn-mIm和纤维素酶@Zn-mIm具有相同的单晶结构。

图2.扫描电子显微镜下a 10微米和b 2微米的Zn- mIm

图3.Zn-mIm和纤维素酶@Zn- mIm的孔径分布曲线

图4.Zn-mIm和Cel-lulase@Zn-mIm的氮吸收-解吸等温线

图5.Zn-mIm模拟、Zn- mIm和纤维素酶@Zn-mIm的粉末X射线衍射图案

图6.纤维素酶@Zn-mIm的扫描电子显微镜和C、N、O、S元素图谱的研究

能量色散X射线光谱图（图6）显示纤维素酶@Zn-mIm中C、N、O和S元素分布均匀。S的存在进一步表明，纤维素酶已被成功地封装在Zn-mIm中，因为S来自纤维素酶。

计算活性恢复率以估计固定化过程中的活性损失。纤维素酶@Zn-mIm的活

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