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摘 要

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌，是一种寄居在人和温和动物大肠内的正常菌群，一般多不致病，是一种普遍存在的原核生物，属于革兰氏阴性短杆菌，主要存在于大肠中^[1]。大肠杆菌的研究从未停止过，对大肠杆菌各段基因的协同作用机理仍在研究中，本实验致力于构建大肠杆菌基因缺失株，采用较为高效的重叠延伸PCR技术，对大肠杆菌中ssrA基因和smpB基因分别作基因敲除^[2]。为后续研究大肠杆菌ssrA基因缺失对大肠杆菌蛋白表达的影响做前期准备，同时与smpB基因缺失株的对比，分析两种基因分别缺失对大肠杆菌的影响。

关键词：基因敲除，重叠延伸PCR，大肠杆菌

Abstract：Escherichia coli (E.coli) is one of the Escherichia genus bacteria, it is a hermit and gentle animal intestine in normal flora, general pathogenic prokaryote belonging to the gram negative bacillus, mainly deposits in the large intestine. Study on Escherichia coli never stopped, the mechanism of pathogenic Escherichia coli is still in the study. In order to study the effect of E.coli ssrA gene deletion on the protein expression, our study mainly built the Escherichia coli ssrA gene and smpB gene deletion strains, using more efficient overlap extension PCR.

Key Word：Escherichia coli, gene knockout, overlap extension PCR

目录

1 材料 4

1.1 菌株和质粒 4

1.2 主要试剂 4

1.3 需配制的试剂 4

1.4 使用仪器 5

1.5 PCR相关材料 5

2 实验步骤 6

2.1 复苏及扩增大肠杆菌 6

2.2 大肠杆菌DNA模板的制备 6

2.3 获得ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2，ssrA-PKD3，smpB-PKD3片段 6

2.4 在PrimeStar酶作用下连接三段产物 7

2.5 扩增连接产物 8

2.6 电转化感受态细胞的制备及转化 9

2.6.1 电转化感受态细胞的制备 9

2.6.2 电转化构建突变株 9

3 实验结果 10

3.1 菌种复苏结果 10

3.2 基因扩增及纯化 10

3.2.1 ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2基因扩增结果 10

3.2.2 ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2四段基因的纯化结果 11

3.2.3 ssrA-PKD3，smpB-PKD3基因扩增结果 11

3.2.4 ssrA-PKD3，smpB-PKD3基因的纯化结果 11

3.3 三段基因连接示意图 12

3.4 将连接产物导入感受态细胞 13

3.5 保存菌种为后续实验做准备 14

结论 15

讨论 15

参考文献 16

致 谢 17

1 材料

1.1 菌株和质粒

本实验使用的菌株E058是由本实验室保存的大肠杆菌的野生菌株，大肠杆菌突变株E058ΔssrA，E058ΔsmpB均由本实验室构建和保存。

表1 本实验中使用的菌株和质粒

菌株/质粒名称	说明	来源
E058	大肠杆菌的野生菌株	本实验室自行分离
E058ΔssrA	大肠杆菌ssrA基因缺失株	本实验室自行构建
E058ΔsmpB	大肠杆菌smpB基因缺失株	本实验室自行构建
DH5α	用于制备感受态细胞	本实验室保存
PKD3	质粒	本实验室保存

1.2 主要试剂

本实验使用的试剂见表2。

表2 本实验中使用的试剂

试剂	外文名称或化学式	来源
酵母粉	YEAST EXTRACT	OXOID
胰蛋白粉	TRYPTONE	OXOID
氯化钠	NaCl	沪试
琼脂粉	Agar-agar powder	沪试
琼脂糖	AGAROSE	BIOWEST
二水合氯化钙	CaCl2·2H2O	上海泗联化工厂
硼酸	H3BO3	北京试剂化学公司
乙二胺四乙酸	EDTA（C10H16N2O8）	上海凌峰化学试剂有限公司
Tris	C4H11NO3	Sunshine
甘油（丙三醇）	C3H8O3	国药集团化学试剂有限公司
乙酸（冰醋酸）	CH3COOH	莱阳市康德化工有限公司
盐酸	HCl	沪试

1.3 需配制的试剂

本实验中需使用部分自行配制的试剂，试剂说明见表3。

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