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摘 要

本文利用大肠杆菌表达系统，构建了蜡状芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶重组表达菌株。通过IPTG诱导，表达和纯化了蜡状芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶，并对该酶的酶学特性进行了初步研究。结果显示：LDH-14579的编码基因约为1100bp，表达的重组亮氨酸脱氢酶约为40kDa。亮氨酸脱氢酶的最适反应温度为37℃；最适反应pH为9.5；Fe² 显著提高了该酶的活性，K 也有助于该酶活性的提高，Mn² ，Al³ 是亮氨酸脱氢酶的抑制剂。

关键词：蜡状芽孢杆菌，亮氨酸脱氢酶，重组酶表达，酶学特性

Abstract: In this paper, a recombinant strain was construct with E.coli BL21 strain using expression vector pET29a. Leucine dehydrogenase gene from Bacillus cereus was expressed and purified. The enzymatic properties of the enzyme were preliminary studied. The results showed that the gene encoding LDH-14579 was approximately 1100 bp and the recombinant leucine dehydrogenase expressed was approximately 40 kDa. The optimum reaction temperature and pH of leucine dehydrogenase is 37℃ and 9.5; Fe² significantly increases the activity of the enzyme, K also contributes to the increase of the enzyme activity, Mn² , Al³ is leucine dehydrogenation Enzyme inhibitors.

Key words: Bacillus cereus， leucine dehydrogenase， recombinase expression，enzymatic properties

目 录

毕业论文独创性声明 2

2 材料与方法 6

2.1 试剂与培养基 6

2.2 供试菌株 7

2.3 重组表达菌株的构建 7

2.3.1 重组质粒的提取 7

2.3.2 E.coli BL21菌株感受态细胞制备 8

2.3.3 质粒转化 8

2.4 重组酶的诱导表达 9

2.5 酶液制备与纯化 9

2.6 SDS-PAGE电泳 9

2.6.1 样品处理 9

2.6.2 SDS-PAGE的灌制 10

2.6.3 跑胶 10

2.6.4 染色脱色 10

2.7 亮氨酸脱氢酶活性检测 10

2.8 酶学特性研究 11

2.8.1 温度对亮氨酸脱氢酶活性的影响 11

2.8.2 pH对亮氨酸脱氢酶活性的影响 11

2.8.3 离子强度对亮氨酸脱氢酶活性的影响 11

3 结果分析 11

3.1 重组表达菌株的构建 11

3.1.1 重组质粒的提取 11

3.1.2 质粒转化 12

3.2 重组酶的诱导表达及纯化 12

3.3 酶学特性研究 13

3.3.1 温度对亮氨酸脱氢酶活性的影响 13

3.3.2 pH对亮氨酸脱氢酶活性的影响 14

3.3.3 金属离子对亮氨酸脱氢酶活性的影响 15

结 论 16

参考文献 17

致 谢 19

1 前言

手性氨基酸是一种重要的医药中间体^{[1, 2]}，它可参与氧化还原反应，因此在药物合成中起着至关重要的作用^{[3, 4]}。在所有的手性氨基酸中，L-叔亮氨酸因其空间位阻大，疏水性强等特点而具备较高的稳定性，故广泛应用于各种药物的合成中^[5]。

手性氨基酸的合成目前主要有两种方法，一种为化学合成法，另一种为生物催化法。传统的化学合成法有许多缺点，如反应条件比较苛刻，立体选择性差，污染大，成本高且副产物多，限制了其在医药合成领域的应用。与化学合成法相比，生物合成法副产物少，成本低，操作简便，绿色环保，在人工合成手性氨基酸药物领域中应用越来越广泛^[3]。

亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase j LeuDH，ECl．4．1．9)是一种NAD 依赖型的氧化还原酶^[9]，该酶能够催化L-亮氨酸和其它一些氨基酸发生脱氨基作用，使氨基酸转化为相应的a-酮酸及其类似物^{[5, 10]}，该反应为可逆反应且需要辅酶参与。Sanwal和Zink在1961年首先在Bacillus cereus中发现并纯化了LDH^[11]。我国学者黎舒婷等人在2009年将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶菌株混合，催化合成手性氨基酸L-叔亮氨酸^[12]。随后，陈依军等人将亮氨酸脱氢酶作为生物催化剂，合成L-叔亮氨酸^[12]。之后，随着人们的深入挖掘与研究，有关亮氨酸脱氢酶催化性能的研究被陆续报道。

以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）一种常用电泳技术，可用于分离蛋白质^[13]。因为聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，不同分子量大小、不同形状的蛋白质在该网状结构中所受的阻力不同，从而达到分离蛋白质的作用。该电泳通常有两种形式，一种为非变性，一种为变性的，主要根据蛋白质的状态来区分。聚丙烯酰胺凝胶不变性的电泳(Native-PAGE)，在电泳过程中能够使蛋白质保持完整的状态，此时蛋白质的迁移速率与蛋白质的相对分子质量、所带电荷以及结构有关。根据蛋白质的大小、形状、带电量就可以达到分离的效果，该电泳方法可以分离活的蛋白，电泳结束后可以切胶回收。在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白质处于变性状态，即蛋白质的高级结构受到破坏，整个蛋白质处于线性状态，该种凝胶电泳只需要根据蛋白质分子量大小就能达到分离不同蛋白质的效果，这种电泳一般用来分离变性蛋白。胶分为浓缩胶和分离胶，浓缩胶是为了使不同大小的蛋白质处于同一起始位置，一般浓度较小，蛋白质在该区域迁移速率大。分离胶可以达到分离蛋白的目的，浓度一般较大，蛋白质在该区域迁移速率较小。APS起着催化丙烯酰胺聚合的作用，TEMED可加速该聚合反应，SDS为变性剂，根据分离蛋白分子量大小选择不同的浓度的浓缩胶与分离胶。

2 材料与方法

2.1 试剂与培养基

Na₃PO₃、NaCl、HCl、N,N,N,,N,,-四甲基乙二胺、过硫酸铵、丙烯酰胺、Tris、咪唑、Glycine、NaOH、冰乙酸、无水乙醇、NaCl等试剂均为实验室常用的普通分析纯试剂。

液体LB培养基：用分析天平称取10g蛋白胨（OXID），加入烧杯中，称取5g酵母粉(OXID)，加入烧杯中，再称取5g NaCl，加入烧杯中，用量筒量取去离子水1000mL，加入烧杯中，混匀，pH自然。

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