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摘 要

亮氨酸脱氢酶是一种NAD 依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，在催化制备L-亮氨酸、叔亮氨酸等方面具有一定的优势。本文利用大肠杆菌表达系统，采用传统的载体构建方法设计并构建了蜡状芽孢杆菌14579菌株亮氨酸脱氢酶重组表达载体pET29a-LDH，为进一步构建基因表达工程菌株提供了材料和理论支撑。

关键词： 亮氨酸脱氢酶、重组表达载体、

Abstract: Leucine dehydrogenase is an NAD -dependent oxidoreductase that reversibly catalyzes the reaction between L-leucine with some branched L-amino acids and corresponding keto acids and their analogues, which has the advantages in producing L-leucine and tert-leucine. In this paper, the recombinant expression vector pET29a-LDH of the leucine dehydrogenase of Bacillus cereus 14579 was designed and constructed by using the traditional E. coli expression system, which provides material and theoretical support for the further construction of gene expression engineering strains

Key words: Leucine dehydrogenase、Recombinant expression vector、

目 录

1前言 5

1.1 蜡状芽孢杆菌和亮氨酸 5

1.2 亮氨酸脱氢酶 5

1.3凝胶电泳 5

2材料与方法 6

2.1仪器和培养基 6

2.2 供试菌 6

2. 3 pT-LDH-14579和空表达载体pET29a宿主菌株活化 6

2.4 质粒提取及电泳验证 6

2.4.1质粒提取 6

2.4.2琼脂糖凝胶电泳验证 6

2.5 质粒限制性内切酶酶切 7

2.6 目标DNA片段及线性化载体切胶回收 7

2.7重组表达载体构建 7

2.8 E.coli DH5α感受态细胞制备及转化 7

2.9阳性转化子筛选及验证： 8

3结果与分析 8

3.1 pT-LDH-14579和pET29a宿主菌株活化 8

3.2 质粒的提取 8

3.3质粒pT-LDH-14579和pET29a酶切及切胶回收 9

3.5 pET29a-LDH14579构建 10

3.6重组质粒pET29a-LDH的提取及酶切验证 10

4 结论 11

参考文献 12

致谢 13

1前言

1.1 蜡状芽孢杆菌和亮氨酸

蜡状芽孢杆菌是一种常见的细菌。它是一种需氧生长的革兰氏阳性杆菌^[1]，已被用作饲料添加剂应用在各种动物饲养实验中，在水产养殖业中取得了良好的效果^[2]。

亮氨酸能加速骨骼生长，叔亮氨酸也是抗肿瘤药物重要成分^[3]，它的合成方法有不少，其中化学合成法和生物酶合成法较为常见。化学合成法中需要一系列的复杂繁琐步骤，并且反应过程中会有不少副产物^[4]。而生物酶合成法操作简单，绿色环保，副产物少^[5]，因而生物催化越来越受到人们的重视。LDH在制备L-亮氨酸等方面具有优势^[6]，因此被广泛应用于各种药物的合成中^[7]。

1.2 亮氨酸脱氢酶

Leucine Dehydrogenase（LDHEC EC1.4.1.9）是一个NAD 依赖的氧化还原酶，将多种酮酸类化合物还原为相应的手性氨基酸^[8]，能够可逆性的催化L-亮氨酸及其它一些脂肪族支链氨基酸发生脱氨基作用^[9]，进而转化为a-酮酸及其类似物^[10]（见图1），其主要参与支链中L-氨基酸的代谢^[6]。在1961年，ShanWar和Zink第一次发现并在蜡状芽孢杆菌中纯化出了LDH^[11]。在尿素脱氢酶偶联法中，LDH也可以用来测定血清中的尿素，拥有出色的抗内源氨的干扰能力^[12]。

图1 亮氨酸脱氢酶催化的可逆反应

1.3凝胶电泳

凝胶电泳技术是实验室里常用的用来分离或验证不同物质的分子技术，它的用途非常广泛，已成为生物、化学和医学等专业研究中一项不可或缺的技术。凝胶电泳图像是获得核酸、蛋白质等遗传物质相对分子量和光密度值的前提和基础，图像的质量直接影响泳道、条带识别和计算^[13]。

2材料与方法

2.1仪器和培养基

仪器：培养箱、离心机、琼脂糖凝胶电泳槽、超净台、

液体LB培养基：酵母粉(OXID)5g，蛋白胨（OXID）10g，去离子水1000mL， NaCl5g， pH自然。

固体LB培养基：在液体LB培养基基础上加入15g琼脂粉。

2.2 供试菌

供试菌：E.coli DH5α菌株（pT-LDH-14579）、E.coli DH5α菌株（pET29a）、E.coli DH5α菌株。

2. 3 pT-LDH-14579和空表达载体pET29a宿主菌株活化

在无菌操作下，用无菌微量吸管，从已溶解的低温保存管中吸取50μL(或1-2滴)的菌液（分别含有pT-LDH-14579质粒和pET29a载体），滴入固态培养基边缘处，用划线法将菌株接种到固态培养基上，接着将培养基置于恒温的培养箱中进行培养。

2.4 质粒提取及电泳验证

2.4.1质粒提取

接1%含有pET29a质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基，37℃振荡培养过夜。取1.5ml菌液于离心管12000rpm离心1min，弃上清液。依次加入0.lml溶液I、0.2ml溶液II、0.15ml溶液III充分翻转混合，置于冰浴5min。并以12000rpm离心5min，取上清液于另一新离心管，加入等量酚：氯仿：异戊醇，，混匀后静置30min，使DNA沉淀。以12000rpm离心5min，小心弃上清。再用70%乙醇洗涤并冷冻干燥，最后溶于50μL TE缓冲液。再用相同方法从DH5α菌株中提取出pT-LDH-14579质粒。

溶液I：1%葡萄糖，50mM/L EDTA，pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0。

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