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摘 要

前体mRNA的剪接，作为真核生物基因转录后水平的一种关键调控机制，对蛋白质的正确翻译及其种类的丰富性发挥出了重要作用。通过其剪接过程，使得前体mRNA成功转变为成熟mRNA，而这一系列步骤则是依赖剪接复合体的催化反应所完成的。剪接复合体的组装需要蛋白与蛋白间的多重相互作用。前期结果表明，SMP1作为剪接复合体中C复合体的组分，通过与其它蛋白间的相互作用被整合到剪接复合体中进而发挥剪接功能。本研究以拟南芥为实验对象，通过构建SMP1、MAC5A的重组质粒，并利用酵母双杂交技术等手段证实SMP1与MAC5A蛋白质间存在直接的相互作用。上述结果对于了解SMP1蛋白在剪接复合体组装过程中的功能具有重要的意义。

关键词：前体mRNA，剪接复合体，SMP1，蛋白质相互作用，酵母双杂交

Abstract：The transition process from pre-mRNA to mRNA is called pre-mRNA splicing. Pre-mRNA splicing, a key regulatory mechanism at the post-transcriptional level, plays an important role in the translation and enhances the protein diversities. Splicing is catalyzed by spliceosome, which assembles by multiple interactions among proteins and snRNAs. Previous studies indicate that SMP1 is recruited to the spliceosome by protein interactions. In this study, we cloned SMP1 and MAC5A, and constructed the SMP1 and MAC5A recombinant plasmids. Moreover, we tested that SMP1 directly interacted with MAC5A in vitro by yeast-two-hybrid assay. The result is of significance for understanding the recruitment of SMP1 during spliceosome dynamic assembly.

Keywords: pre-mRNA, spliceosome, SMP1, protein interaction, yeast-two-hybrid

目录

1 引言 4

1.1 前体mRNA剪接 4

1.1.1 前体mRNA剪接的催化反应实质 4

1.1.2 剪接复合体的动态组装 5

1.2 植物中SMP1蛋白研究进展 7

1.3 酵母双杂交研究进展 8

1.3.1 酵母双杂交的原理 8

1.3.2 酵母双杂交的应用 9

2 材料与方法 9

2.1 实验材料及试剂 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 RNA提取 9

2.2.2 反转录 10

2.2.3 PCR扩增 10

2.2.3.1 PCR扩增基因 10

2.2.3.2 琼脂糖凝胶回收PCR产物 11

2.2.4 质粒提取 11

2.2.5 酵母双杂交 11

3 结果与分析 12

3.1 AD-SMP1重组子的构建 12

3.1.1 SMP1基因扩增 12

3.1.2 菌落PCR鉴定AD-SMP1重组质粒 13

3.2 BD-MAC5A重组子的构建 13

3.2.1 MAC5A基因扩增 13

3.2.2 菌落PCR鉴定BD-MAC5A重组质粒 14

3.3 AD-SMP1与BD-MAC5A直接相互作用 14

结论 16

参考文献........................................................ 17

致谢 20

1 引言

1.1 前体mRNA剪接

前体mRNA分子的剪接过程发生在真核生物中，通过转录后加工成为成熟的mRNA，再经历翻译形成蛋白质后发挥生物学功能^{[1, 2]}。作为基因转录后水平以及真核生物基因表达的重要调节机制之一，前体mRNA的剪接对于mRNA的成熟、蛋白质翻译和生物体本身的生长发育等也具有重要影响^{[2, 3]}。

1.1.1 前体mRNA剪接的催化反应实质

由两步连续的转酯反应催化完成mRNA前体的剪接^[4]，这两步转酯反应断裂mRNA前体的原有磷酸二酯键，产生新的磷酸二酯键。第一步：由保守腺苷酸的2’-OH引发，作为亲核基团攻击5’剪接位点的磷酰基团（保守鸟苷酸处），结果是3’外显子和5’外显子的核糖与磷酸基团之间磷酸二酯键断裂，分 成一个游离的外显子和一个含套索样结构的外显子；第二步：由5’外显子的3’-OH作为亲核基团，攻击3’剪接位点的磷酰基团。一方面连接3’外显子和5’外显子，另一方面将含套索结构的内含子当作离去基团而释放出去 ^[5-7]（图1）。

图1 核前体mRNA的两步转酯反应催化（上图）和过渡态（下图）

黑白方框分别代表的是3’外显子和5’外显子；蓝色实线代表的是内含子；Br.A代表的是分支处的腺苷酸 ；黄色实线代表的是亲核攻击^[6]。

Figure 1 Two-step transesterification of nuclear precursor mRNA (top) and transition state (bottom)

The black and white boxes represent the 3" exon and the 5" exon respectively; the blue solid line represents the intron; the Br.A represents the adenylate at the branch; the yellow solid line represents the pro Nuclear attack.

1.1.2 剪接复合体的动态组装

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