论文总字数：23341字

摘 要

在遗传育种的领域，发挥植物杂种优势是增加农作物产量的一条重要途径，而雄性不育是水稻杂交育种的重要手段。目前在水稻中发现有6个与HOTHEAD前体同源的基因，其中Os10g38050已经报道与水稻雄性不育相关，该基因被注释为OsNP1。具有osnp1-1基因的水稻花药较小，颜色发白，并且不产生花粉，大约87-92%的小穗柱头外露。更主要的是，其不育性不受光照和温度影响。本文对水稻其它五个基因Os08g31030、Os06g44540、Os04g48400、Os03g02700、Os02g45530以及其它家族的两个基因Os01g56800、Os03g47990进行了生物信息学分析，并获得了相关基因的基因编辑突变体。通过表型分析以及基因测序分析结果，我们希望可以获得新的雄性不育突变体。

关键词：水稻，雄性不育，HOTHEAD基因，生物信息学，基因编辑

Abstract: In the field of genetic breeding, plant heterosis is an important way to increase crop yield, and male sterility is an important means of rice cross breeding. At present, six homologous genes to the HOTHEAD precursors have been found in rice. of which Os10g38050 has been reported to be associated with male sterility in rice, which is annotated as OsNP1. Rice with osnp1-1 gene has smaller anthers, whose color is white and no pollen production, and about 87-92% of the spikelet’s spike heads are exposed. More importantly, its sterility is not affected by light and temperature. In this paper, bioinformatics analysis was carried out on the other five genes Os08g31030, Os06g44540, Os04g48400, Os03g02700, Os02g45530 and other families of rice, Os01g56800, Os03g47990, and the gene editing mutants of related genes were obtained. Through phenotypic analysis and gene sequencing analysis, we hope to obtain new male sterile mutants.

Keywords: rice, male sterility, HOTHEAD gene, bioinformatics, gene editing

目录

1 引言 7

1.1 水稻雄性不育系 7

1.1.1 水稻雄性不育系的分类 7

1.1.2 水稻雄性不育系的应用 7

1.2 水稻中的HOTHEAD家族基因 8

1.3 基因编辑技术 9

1.3.1 基因编辑技术的发展 9

1.3.2 CRISPR/Cas9的执行过程 11

2 材料与方法 11

2.1.1 材料 11

2.1.2仪器与药品 11

2.2方法 12

2.2.1 样品破碎 12

2.2.2 CTAB提取液的配置 12

2.2.3 CTAB法提取水稻总DNA 12

2.3 PCR法获取目的基因 13

2.3.1 预实验 13

2.3.2 使用50微升（µl）GCI扩增体系获取目的基因 13

2.4 水稻基因测序 14

3 结果与分析 15

3.1 待测样品的表型分析 15

3.2 根据电泳图谱挑选目的基因 16

3.3 测序样品编号及突变位点分析 18

3.4 系统进化树分析 23

3.5 基因的表达分析 24

结论 25

致谢 30

1 引言

水稻种植在中国具有悠久的历史，人们在长江下游发现了距今约9000年的水稻植物体残留^[1]，因此水稻是中国发展过程中主要的农作物之一，也是当今世界最重要的粮食作物之一^[2]。水稻育种在近现代经历过三次革命，其中包括五十年代的水稻矮化育种，七十年代进行的杂交育种，八十年代对超级杂交稻进行高产育种。在遗传育种的过程中，增加农业生产量的一个非常重要途径是发挥植物杂交后产生的表型优势，而通过利用水稻的雄性不育株进行育种是水稻杂种优势利用的重要技术手段^[3]。

1.1 水稻雄性不育系

水稻雄性不育系是一类特殊类型的水稻，其自身花器中，因为各种外部因素，如温度、湿度，以及某些水稻本身的内在因素影响，雄性器官（花药）发育不完善，无法产生正常的花粉，但其雌性器官发育正常。是以其不能通过自交进行繁殖，只有借助于外来水稻的花粉才可正常受精，结出的种子具有萌发及生长能力。雄性不育系水稻植株与接受来自雄性不育保持系水稻的花粉，结出的种子在下代种植表型仍然是不育系^[4]。雄性不育系水稻植株接受雄性不育恢复系水稻的花粉，结出的种子就是杂交稻种子，花药可正常发育，育性恢复，也就是在农业大面积生产上所使用的种子^[4]。

1.1.1 水稻雄性不育系的分类

水稻雄性不育系主要可以被分为核质互作不育型和核不育型^[5]。核不育型又可分为光温敏核不育系（两系不育系）与普通核不育系^[6]。

根据决定水稻雄性不育性状的基因与对应的决定水稻雄性可育性状基因之间的显隐性关系，又可将水稻雄性不育系分为隐性核不育和显性核不育，其中约88 %的雄性核不育属于隐性核不育^[7]。

1.1.2 水稻雄性不育系的应用

在我国，对杂交水稻的育种最先是从核质互作不育系的应用开始的^[8]，通过利用核质互作雄性不育系、与不育系对应的水稻保持系以及水稻恢复系配置水稻的杂种一代^[9]，及所谓的三系配套。自二十世纪七十年代开始，核质互作不育系（CMS）杂交品种就已投入商业化生产，2012年覆盖了中国大约40％的水稻种植区^[10]。尽管应用广泛，但CMS系统存在几个固有问题，包括恢复系的种质资源狭窄，CMS系和恢复系之间遗传多样性差，某些天气条件下雄性不育的不稳定性，异常线粒体基因对杂交性能的负面影响，以及在育种系中培育新特性的难度^[10-12]。这些问题限制了CMS杂交育种的进一步改善，这被认为是CMS品种在过去20年达到产量平台的原因^{[10, 11]}。其中两系不育系在国内的应用比例越来越高，具有配组自由、恢复系广、杂交过程简单等优点^[6]。两系不育系的基因已经被克隆：一个是非编码RNA基因^{[13, 14]}，以及其他RNA酶Z^s1的编码^[15]。

两用核雄性不育水稻的雄性生殖力在环境中是可逆的，应用其在较高温度时表现的不育性与水稻恢复系进行杂交制备种子，利用其在较低温度下表现出的可育性进行繁殖 ,即通常所说的一系两用^[16]。光温敏核雄性不育水稻于1995年首次用于农业，到2012年，其种植面积迅速增加，几乎覆盖了中国20％的稻田。目前，在中国种植的产量最高的品种主要就是两系不育系杂交种^{[10, 11]}。 但一系两用这一育性特点也决定了两用核不育系育性的不稳定，其生育能力受环境条件的调节，因此在制备种子时，较低的环境温度可以使得水稻不育系育性恢复，从而导致杂交种子不纯，在繁殖的过程中，较高的环境温度又会引起水稻不育系可育度的降低，导致繁殖产量减少^[17]。此外，在两系不育系中，其育性转化的临界温度经常在几代传播后发生变化，与合适的临界温度对应的两系不育系个体在生产过程中必须反复重新分离。 加上两系不育系特性受遗传背景的影响，显著增加了培育新的实用两系不育系的难度和不确定性^[18]。

1.2 水稻中的HOTHEAD家族基因

植物的雄性生殖发育涉及一系列事件，从雄蕊分生组织分化到花粉粒形成和授粉，任何这些事件的缺陷都可能导致雄性不育。目前在水稻中鉴定出了雄性育性所需的四十多种核基因^{[10, 19, 20]}，但由于没有很好的方法在大规模生产上获得纯雄性不育的水稻种子，因此这些基因尚未用于杂种生产。在植物中，由多糖和表皮脂质构建的细胞外基质聚合物具有结构和保护功能。有遗传和生化上的证据表明，HOTHEAD参与长链α-，ω-二羧酸脂肪酸生物合成和细胞外基质的形成^[21]。在水稻中目前发现有6个与HOTHEAD前体同源的基因，其中Os10g38050已经报道与水稻雄性不育相关，该基因被注释为OsNP1。

从雄蕊原基的形成到花药开裂期间成熟花粉的释放，显微镜分析将水稻花药发育分为14个阶段^[22]。到第6阶段，野生型水稻花药原基分化成同心结构，花粉母细胞（PMCs）在细胞周围被四层花药壁包围，从表面到内部依次为表皮，内皮，中间层和绒毡层。PMCs随后经过减数分裂，在第八阶段结束时产生四分体。同时，绒毡层细胞启动程序性细胞死亡（PCD），中间层变得几乎不可见^[22]。野生型水稻花药表皮在早期发育阶段被光滑的角质层覆盖，其在阶段11和12逐渐变厚并形成网格状结构，但在osnp1-1花药的表面上没有形成网格状结构^[23]。实时定量PCR显示OsNP1在减数分裂期间（第7和第8阶段）在花药中特异性表达，因此OsNP1是花药特异性基因^[23]。花药表面角质层由角质和内外表皮蜡质组成。角质是由ω-中链羟基和环氧树脂C16-C18 FAs组成的聚合物，而表皮蜡质主要由长链脂肪酸组成^{[24, 25]}。在水稻中，花药表面角质层和孢子粉蛋白的脂质前体可能在绒毡层中产生，然后通过乌氏体分泌并转运到花药和小孢子表面^{[19, 26]}。一些水稻雄性不育突变体在绒毡层脂类代谢或转运上存在缺陷，而在发育中也有乌氏体、花粉外壁和花药表面角质层的缺陷^[27-29]。在水稻的花发育过程中，OsNP1编码决定了的葡萄糖 - 甲醇 - 胆碱氧化还原酶调节绒毡层变性和花粉外壁形成，该基因特别在绒毡层和杂种孢子中表达。

OsNP1发生突变的水稻可以进行正常的营养生长，但表现为对外部环境条件完全不敏感的雄性不育。通过改良的MutMap法克隆osnp1-1突变基因^[30]，分析确定了染色体10末端（从21.27到22.05 Mbp）的候选区域，其中包含4个候选SNP：其中两个位于基因间区域，一个位于LOC_Os10g39044的内含子中，一个（Chr10：20,379,153）位于LOC_Os10g38050的第三个外显子中，导致从Gly561（GGC）到Asp的氨基酸取代（ GAC）^[23]。将osnp1与α-淀粉酶基因互相结合可以使转基因水稻的花粉失去活性，与红色荧光蛋白（DsRed）基因相互结合则能够于产生的转基因种子打上标记，从而转化为OsNP1突变体。基因组内携带有单个半合子转基因的转基因植物的自花授粉产生1：1比例的非转基因雄性不育和转基因可育种子，其可以基于红色荧光蛋白编码的红色荧光进行分选。可育的转基因水稻与非转基因雄性不育水稻可通过异花授粉收获高纯度的雄性不育种子。 将雄性不育系与约1200个单独的水稻种质杂交，大约85％的F1在单株产量上优于其亲本，10％的产量超过了当地最佳品种^[23]。该系统基本上优于目前的细胞质雄性不育和光周期/热敏核基因雄性不育系统， 该技术的应用将大大提高杂交水稻育种和生产的有效性和效率。在水稻中发现的其余五个HOTHEAD家族基因分别是Os08g31030、Os06g44540、Os04g48400、Os03g02700和Os02g45530。

1.3 基因编辑技术

基因编辑技术是指可以使人们针对特定的目标基因操作和编辑，从而实现对目的DNA片段进行敲除、加入等操作^[31]。目前主要的基因编辑技术有锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和RNA引导的CRISPR／Cas核酸酶技术三种^[32]，其中RNA引导的CRISPR／Cas核酸酶技术是新型的基因编辑技术。

1.3.1 基因编辑技术的发展

在基因编辑技术中，锌指核酸酶 （zinc-finger nucleases，ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN ）是具有代表性的序列特异性核酸酶技术，它们能够以很高的效率地进行定点基因组编辑^[33]， 因此在基因和基因组研究、基因治疗和遗传改良等方面展现出了极好的发展前景，但近年来由于其设计复杂，实验过程较为繁琐，已经被CRISPR/Cas取代^[34]。CRISPR/Cas技术是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”，和前两代基因编辑技术（ZFN、TALEN）相比，CRISPR/Cas具有实验成本低、工具制作相对容易、实验过程高效快速的优点，这使它成为科学研究、医学治疗等领域重要的工具^[35]。和真核生物中的miRNA干扰现象类似，CRISPR/Cas是细菌、古细菌在长期的进化中所产生的特异免疫机制。该系统对于从环境中进入菌体的核酸的响应过程可被分为以下三个步骤：（1）外源刺激引起CRISPR序列的活化，转录复合物形成；（2）CRISPR基因以细胞水平表达；（3）CRISPR/Cas结合外源基因，对其进行剪切^[36]。CRISPR/Cas主要可被分为I、II、III 三个类型，其中由于II型CRISPR系统（CRISPR/Cas9）在步骤与涉及组分上更为简便，是目前基因编辑所研究的主要系统。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9基因编辑技术的核心蛋白元件，已经成熟的crRNA与外源基因结合后形成复合物，Cas9蛋白再与它们相互结合实现对外源核酸的酶切^[34]。该技术被认为可以在活细胞中最便捷、有效地“编辑”任何基因^[37]。

1.3.2 CRISPR/Cas9的执行过程

图 1 CRISPR/Cas9结构示意图

如图 1所示，5’端的tracrRNA转录后可与3’端的spacers序列转录形成的前体crRNA通过碱基互补配对折叠成双链RNA（tracrRNA/crRNA二元复合体），该二元复合体可指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特异位点对双链 DNA进行剪切^[34]；Cas9、Casl、Cas2和 Csn2是Cas蛋白的编码序列，在DNA复制、转录、翻译过程中分别具有不同作用，其中Cas9起到核酸酶的作用^[34]。Cas9主要包含有两个结构域：HNH核酸酶结构域以及RuvC-like结构域。HNH核酸酶结构域可剪切与crRNA互补的序列，RuvC-like结构域剪切crRNA的非互补的序列^[34]。3’端是CRISPR基因座，由启动子区域、重复序列(一般21-48bp，序列不严格保守)以及间隔序列组成，重复序列中的回文序列在Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物的过程中起着重要的作用，间隔序列决定了CRISPR系统的特异性^[34]。

2 材料与方法

2.1.1 材料

共七份水稻样品，详见表 1。

2.1.2仪器与药品

仪器：2ml离心管、组织研磨机、1.5ml离心管、钢珠、磁力搅拌器、电子天平、烧杯、PH计、移液枪、量筒、锥形瓶、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统。

药品：液氮、Tris-Cl、Na2EDTA·2H2O、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、CTAB、氯仿、异丙醇、乙醇、蒸馏水、超纯水、6﹡loading buffer、琼脂糖粉末、DNA Marker、goldview。

2.2方法

2.2.1 样品破碎

取适量水稻叶片样品转入2ml离心管，每管加入两粒钢珠后编号，盖紧放入液氮速冻，再经组织研磨机研磨后制得破碎后的样品。

2.2.2 CTAB提取液的配置

配置1mol/L,PH8.0的Tris-Cl 500ml：用电子天平称60.55g Tris，将其倒入容量为1升的烧杯中，量筒取大约400ml蒸馏水倒入烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器使其完全溶解，使用滴管逐滴加入浓盐酸，将其PH调节至8.0，定容后转入玻璃瓶中保存待用；

配置0.5mol/L,PH8.0的EDTA 500ml：使用天平称93.06g Na2EDTA·2H2O，将其倒进容量为1升的烧杯中，量筒取大约400ml蒸馏水倒入烧杯，将烧杯置于磁力搅拌器，在其溶解的过程中加氢氧化钠直至溶液PH达到8.0，等到完全溶解，定容后转入玻璃瓶中保存待用；

配置CTAB抽提液1L：取Tris-Cl（1mol/L,PH8.0）100ml，EDTA（0.5mol/L,PH8.0）40ml，氯化钠81.9g，CTAB 20g，用蒸馏水溶解，定容至1L。

2.2.3 CTAB法提取水稻总DNA

已获得破碎后的样品，每管加850微升（µl）CTAB提取液，确保样品与CTAB提取液充分混合，在65℃烘箱中放置45至50分钟，在第十五分钟及第三十分钟时上下颠倒，使其进一步混匀；

室温放置冷却至室温，加入800微升（µl）氯仿（等体积）抽提溶于提取液的DNA，置于离心机中，转速调至10000rpm，离心8min；

将抽提得到的上清液转入1.5毫升（ml）新管子；

在上清液中注入500微升（µl）异丙醇，12000rpm离心8分钟，能看到白色沉淀，倒掉溶液留下沉淀；

得到的沉淀使用浓度为70%的酒精洗涤，离心机离心是沉淀依附于离心管底部，倒去酒精，待沉淀干燥后溶解于200微升（µl）超纯水。

2.3 PCR法获取目的基因

2.3.1 预实验

15微升（µl）体系，模板HD77第2、3、4号材料，待测引物：GP4505,GP4482,GP7818,GP7819,GP7820,GP7821,GP7822，共21管。

15µl普通扩增体系：10×Buffer 1.5µl；dNTP 1µl；F引物 1µl；R引物 1µl；rTag 0.1µl；超纯水 9.5µl；DNA 1µl。

15µl GCI扩增体系：2×GC Buffer I 7.5µl；dNTP 1µl；F引物 1µl；R引物 1µl；rTag 0.1µl；超纯水 3.4µl；DNA 1µl。

PCR扩增温度：首先在94.0°维持3分钟，使双链DNA完全解链为单链DNA，随后进入（94.0°30秒，55.0°30秒，72.0°1分钟）共计35个循环，最后维持72.0°三分钟，使延伸过程充分进行，得到完整双链DNA，降温至25°，结束。在扩增得到的目的基因中加入10µl 6﹡loading buffer（上样缓冲液）。

配置2%琼脂糖凝胶，第一格使用marker试剂，点样完毕后进行电泳。

电泳：TBE电泳液，110V电压，30-40分钟。

预实验分析：普通扩增体系的扩增效果很不理想，GCI扩增体系的扩增效果较好，扩增基因都在250-500bp之间。

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