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摘 要

本文通过菌种分离和选育得到一株以产β-环糊精为主的BC29菌株，在此基础上，为了获得高的酶产量对菌株的产酶发酵条件进行优化。通过对不同碳、氮源试验，得出该菌最适碳、氮源。然后利用Plackett Burman试验设计，从中筛选出可溶性淀粉、硫酸铵、碳酸钠3种对菌种发酵产酶影响较大。最后经响应面分析，得出实验结果：15g/L蛋白胨，0.75g/L K₂HPO₄，0.1g/L MgSO₄˙7H₂O，10g/L可溶性淀粉，15g/L硫酸铵，6g/L碳酸钠为最优培养基组成，接种量为0.8ml。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶，发酵条件，优化

Abstract: In this paper ,a strain of BC29 mainly producing β-cyclodextrin was obtained by strain isolation and breeding. On this basis of this, The optimum carbon and nitrogen sources were obtained by testing different carbon and nitrogen sources. On the base of Plackett Burman design was used to screen out three kinds of soluble starch, ammonia sulfate and sodium carbonate which have great influence on enzyme production by strain fermentation. Finally by response surface analysis, draw the result: 15g/L peptone, 0.75g/L K₂HPO₄, 0.1 g/l MgSO₄ ·7H₂O, 10g/L soluble starch, 15g/L ammonia sulfate and 6g/L sodium carbonate were the optimal medium composition. inoculation 0.8ml inoculum amount.

Keywords: Cyclodextrin glycosyltransferase, fermentation conditions, optimization

目 录

1 前言 3

2 实验材料与实验方法 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌种 4

2.1.2 培养基 4

2.1.3 主要实验仪器 5

2.1.4 实验试剂 5

2.2 实验方法 5

2.2.1 菌种的筛选 5

2.2.2 粗酶液的制备 6

2.2.3 酶活测定 6

2.2.4 产CGTase菌株发酵条件的优化 7

2.2.4.1 种子培养 7

2.2.4.2 碳源优化 7

2.2.4.3 有机氮源的优化 7

2.2.4.4 无机氮源的优化 7

2.2.4.5 PB实验 7

2.2.4.6 响应面分析 8

3 结果与讨论 8

3.1 初筛结果 8

3.2 复筛结果分析 9

3.3 不同碳源对菌株产酶的影响 10

3.4 不同有机氮源对菌株产酶的影响 10

3.5 不同无机氮源对菌株产酶的影响 11

3.6 PB实验分析 12

3.7 响应面结果分析 13

3.8 验证实验分析 18

结 论 20

参 考 文 献 21

致 谢 23

1 前言

在大自然环境中，空气、泥土、腐烂的动物尸体、水中等无处不存在微生物资源。随着人们积极探索和研究这些微生物资源，近年来，人们利用生物技术，根据微生物在生长和代谢等方面的不同进行发酵工业的生产^[1]，对此的开发和利用也成为了人们研究的热点。

环糊精葡萄糖基转移酶是通过微生物发酵产生的一种胞外酶，既是一种独特的转糖苷酶也是一种水解酶，在-淀粉酶家族中起着至关重要的作用^[2]；具有催化环化、水解、偶合和歧化反应的多功能型酶，因此，CGTase具有催化淀粉合成环糊精的作用^[3]。

以α-1，4-糖苷键通过6—12个D-吡喃葡萄糖基组成的环糊精，、、是3种最为常见的环糊精，葡萄糖残基组成的个数为：6、7、8^[4]。环糊精最大的特点就是中间有一孔洞，外部呈亲水性，内部呈疏水性，与许多有机物质形成包合物，以提高它们的溶解性和稳定性^[5]，且、、这三种环糊精的孔洞大小也是不一样的，其结构如图 1所示^[6]。结构特点不同的环糊精在应用领域方面也大不相同，环糊精在食品和医药应用方面占据了首位，、环糊精目前还没有被广泛应用，主要是在成本价格高及本身的结构导致分离纯化方面受到了一定的限制^[7]。环糊精的使用虽然居首位，但生产菌的酶产量都不是很高，因此，为了提高菌株的产酶活力，我们需要用适宜的生产方法和优化培养条件挑选出优良的菌种^[8]。在有关环糊精生产方法的报道中，其中多为酶法和发酵法，化学合成方法难度比较大且价格十分昂贵^[9]。

目前，在食品、化妆品、医药、农业、环境保护等越来越多行业应用到环糊精，使其也越来越成为人们关注的焦点^[10]。在食品领域中，很多活性物质能够被环糊精包结，起到食品防腐、保鲜的作用；保护食品中的色素；防止食品被氧化以及光和热的分解；使食品中的某些异味排除掉等^[11]。在医药领域中，环糊精也扮演着重要的角色。目前，环糊精逐渐开始成为新型的药物载体，使药物在稳定性、溶解度、溶解速率方面得到了改善；药物在固体剂型中的反应减少了；药物的刺激性及副毒作用大大降低，脂质被改变以及掩盖不良味道、液体甚至气态物质的粘性，使其固体化，从而使药物易于混合和形成^[12]。在环境保护领域中，促进去毒、吸收环境污染物、溶解或萃取去环境污染物、控制环境污染源的释放、对弱极性有机物的降解，作为处理剂对污水进行处理等^[13]。在化妆品领域中，有助于稳定活性成分、挥发性物质；抗氧化、光诱导、热解等作用。在化妆品工业上，CD的复合物可以稳定活性成分。使疏水物质的溶解度得到增加。化妆品中的活性物质有许多都是酯溶性的。屏蔽不良作用：抑制自由基的产生，不良气味的刺激性大大减少；可控释放芳香油等物质的释放^[14]。在农业领域中，催化毒性分子的分解；吸收有害物质；增强农药的稳定效应和增溶性；促进植物的生长，相当于植物生长调节剂；保持药效，去除农药难闻的味道等^[15]。

近年来，随着生物技术的不断发展，现在在环糊精生产这方面的研究中还存在环糊精葡萄糖基转移酶发酵产酶活力水平比较低、相对较差的热稳定性以及工业应用方面的研究还不广泛等一些问题需要解决。国内和国外在环糊精葡萄糖基转移酶研究上的侧重点也不一样，国外主要研究是基因工程菌的构建及酶学性质方面的改造，在发酵工艺动力学方面的探究还有需进一步；而菌种的分离纯化，酶学性质、结构及产酶条件方面的优化是国内目前的研究重点^[16]。为了进一步大范围的应用，本文的研究目的主要在：通过工艺优化技术开发出一株工业CGTase，对生长分化过程中的酶合成进行了优化，使酶的活性达到最大值，同时探究产酶的成本问题等^[17]。

图 1 α-、β-、γ-环状糊精的结构

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