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摘 要

紫萍（Spirodela polyrhiza)又名水萍，天南星目，浮萍科，紫萍属。紫萍分布极为广泛，具有生长快、适应性高、集氮能力强等特点^[1]，所以在污水厂等污水处理中常常被用作生物治理的一种方式。在紫萍对氮元素的利用中，紫萍主要通过GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/ 谷氨酸合成酶)循环同化，谷胺酰胺合成酶（GS）催化氨与谷氨酸转变为谷氨酰胺，从而将无机氮转化为有机氮。本实验的研究对象是位于紫萍第五条染色体上的GS1-2基因，通过基因工程等一系列技术，以紫萍的cDNA为模板得到6号染色体上GS1-2基因的所有外显子序列，为今后其他相关的实验研究打好基础。

关键词：紫萍，谷胺酰胺合成酶，GS1-2基因，基因工程

Abstract：Spirodela polyrhiza, belong to Lemnaceae, is one duckweed species. The distribution of Spirodela polyrhiza is extremely wide, with the characteristics of fast growth, high adaptability and strong nitrogen removal ability. Therefore, it is often used as a method of biological treatment in wastewater treatment such as sewage treatment plants. In the nitrogen metabolic pathway, Spirodela polyrhiza is mainly use GS/GOGAT (glutamine synthetase/glutamate synthetase), and glutamine synthetase (GS) catalyzes the conversion of ammonia and glutamic acid, and then Aminoamide to convert inorganic nitrogen to organic nitrogen. The research object of this experiment is to clone and sequence the cDNA of GS1-2 gene located on the fifth chromosome of Spirodela polyrhiza. Through the genetic engineering and other techniques, all the exon sequences of the GS1-2 gene on chromosome 6 are obtained by using the total cDNA of Spirodela polyrhiza as a template. This experiment lays the foundation for other relevant experimental research in the future.

Keywords：Spirodela polyrhiza, glutamine synthetase, GS1-2 gene, genetic engineering

目录

1 前言 1

2 材料与方法 2

2.1 实验材料与试剂 2

2.2 实验仪器 2

3 实验方法 3

3.1 提取总RNA 3

3.2 cDNA第一条链合成 3

3.3 目的基因的扩增 3

3.4 凝胶电泳分析PCR产物 4

3.5 目的基因片段的连接与转化 4

3.5.1 制备LB培养基 4

3.5.2 TA克隆 4

3.5.3转化 5

3.6 挑菌和检测 5

3.6.1 挑菌 5

3.6.2 阳性菌检测 5

4 结果与分析 6

4.1 PCR扩增序列片段结果分析 6

4.2转化结果检测与分析 6

4.3 阳性菌检测与分析 7

4.4 测序结果与分析 7

4.4.1 NCBI中BLAST结果分析 8

4.4.2 蛋白质结构域分析 9

4.4.3 qPCR引物设计 10

结 论 12

参 考 文 献 12

致 谢 14

1 前言

现代社会发展十分迅速，无论是发展中国家还是发达国家都离不开工业发展的支持，但大部分地区国家并没有与之相匹配的环境管理保护制度，这就导致大量的工业废水被随意的排放入河流、湖泊中。特别对于一些面积较小的水体，自我净化能力本来就较弱，加之一些生活污水的排放，很容易造成水体的富营养化，严重破坏水生生态系统平衡。水体中突增的氮、磷等元素加速了浮游生物的生长^[2]，短期内会消耗水体中的大部分溶氧，严重影响其他物种的呼吸作用和光合作用，死亡的动植物在经过腐烂又会分解更多的氮磷物质进入水体，以此形成一个恶性循环。这样不但严重影响人类正常的生活作息，更是不利于环境资源持续稳定的发展。近年来，在人类意识到这一问题的严重性后，寻求快速有效的方法净化治理被污染的水体已经成为社会的焦点问题^[6]。

经过大量研究数据表明浮萍脱氮效果非常显著。浮萍除了分布广泛，还具有易生长，富集氮的特点，被广泛的应用于对污水的净化处理中。还有一点特别重要的原因是浮萍虽然生长速度极快，覆盖在水面上会导致水下的一些浮游植物无法进行正常的光合作用，但是由于不会沉底的特点，打捞会非常便利，打捞起来的浮萍由于富含氮元素还可用于生产生物饲料等。因此，结合浮萍的这些特性，经过系列的实验研究，已经被应用于多种废水的处理方案中^[2]。

浮萍吸收环境中的氮源并在体内循环加以利用的机理主要是通过GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/ 谷氨酸合成酶)循环同化。主要循环过程如下：首先，硝酸盐经过载体转运进入胞质中，硝酸还原酶（NR）将硝酸盐氧化成亚硝酸盐^[6]，接着亚硝酸盐在铁氧还原蛋白NADP还原酶的催化下被氧化成氨气，最后一系列氧化还原反应，通过嘧啶代谢和谷氨酸代谢，水体中的无机氮最终被浮萍吸收利用。除此之外，氨根离子还可以通过蛋白降解、固氮作用、液泡储存和光呼吸作用产生，在谷氨酰胺合成酶(GS)的催化下转变成谷氨酰胺，谷氨酰胺再与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，然后在谷氨酸合酶(GOGAT)的催化下产生2个分子的谷氨酸。一个谷氨酸再次进入循环中，而另外一个则进入其他代谢途径合成核酸，蛋白质等物质。

GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/ 谷氨酸合成酶)循环同化是浮萍利用水体中无机氮的主要方式，找到并分析循环途径中起关键作用的催化酶并研究编码该蛋白质的基因序列是非常必要的。通过对该循环途径的分析，可以发现在浮萍在利用氮源的过程中，谷氨酰胺合成酶（GS）起着至关重要的作用。经过查找资料文献，发现对于该序列的研究比较缺乏，所以为了更加深入研究浮萍氮同化的具体作用方式^[3]，在不同条件下该基因表达量差异等，为今后污水治理等实际应用打好基础，需要以紫萍的cDNA^[3]为模板得到6号染色体上GS1-2基因^[1]的所有外显子序列。对此，我进行此实验，通过研究该功能序列，为改善水体污染现状提供更多污水治理的方案，以期对今后的深入研究和实践应用有所帮助^[2]。

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