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摘 要

水体的富营养化严重影响了人类社会水资源的利用以及人类的健康。浮萍具有生长迅速、繁殖能力强的特点，并且浮萍中的谷胺酰胺合成酶（GS）可以催化氨与谷氨酸转变为谷氨酰胺，将富营养化的水体中的无机氮转变为供机体使用的有机氮，从而改善富营养化的现状。为了弄清GS在氮同化的具体作用方式，本实验主要研究位于浮萍GS1-3基因的具体功能序列。通过对比浮萍基因组文库并且利用浮萍cDNA作为模板，通过基因克隆的手段获得紫萍14号染色体上GS1基因的cDNA全长序列成功扩增并保存该基因片段，为更深入的研究做准备。

关键词：紫萍，富营养化，GS1-3基因，PCR扩增

Abstract: The eutrophication of water bodies has seriously affected the use of water resources in human society and human health. Duckweed has the characteristics of rapid growth and strong reproductive ability. Glutamine synthetase (GS) in duckweed can convert ammonia and glutamic acid into glutamine, and convert inorganic nitrogen in eutrophic water into the organic nitrogen used by the body to improve the status of eutrophication. In order to clarify the specific mode of action of GS in nitrogen assimilation, this experiment mainly studies the specific functional sequences of the GS1-3 gene in duckweed. By comparing the duckweed genomic library and using duckweed total cDNA as a template, the full length cDNA sequence of the GS1 gene on the chromosome 14 of Spirodela polyrhiza was successfully amplified by gene cloning and the gene fragment was saved to prepare for further research.

Keywords: Spirodela polyrhiza, eutrophication, GS1-3 Gene, PCR amplification

目录

1 前言 2

2 材料与方法 3

2.1 实验材料 4

2.1.1 材料与试剂 4

2.1.3 仪器与设备 4

2.2 实验方法 5

2.2.1 合成cDNA 5

2.2.2 目的基因的扩增 5

2.2.3 TA克隆连接 6

2.2.4 LB培养基的配置 6

2.2.5 转化 7

2.2.6 挑菌与送样检测 7

2.2.7 实验材料的处理 7

3 结果分析 8

3.1 PCR扩增片段分析 8

3.2 连接、转化与阳性菌的检测 8

3.3 测序结果 10

3.1.1 BLAST序列比对 10

3.3.2 DNA序列分析 11

3.3.3 氨基酸序列分析 12

3.3.4 蛋白质结构域分析 13

3.3.5 荧光PCR(qPCR)引物的设计 13

结论 15

参考文献 15

致谢 16

1 前言

水体富营养化，一般指的是人为导致的，是由于水体中N、P等元素过多而产生的水质污染的问题。当代中国经济快速发展，人口数量逐年激增以及工业的迅速发展，不可避免地对环境造成巨大的负担。由于没有受到严格的管治，生活污水以及工业废水随意的排放，因此，过量的营养物质进入中国的河流、湖泊以及江海，水体中N、P等元素逐渐增加，水体中的浮游植物吸收了氮、磷等营养元素从而疯狂生长。由于水中的氧含量下降，进一步的影响了水生植物，从而导致了生物群落结构的改变以及水资源的发黑发臭，最终影响了人类的生活与健康。面对这种现状，可以通过对源头的控制，防止营养化的局面日趋严重；对于已经污染的水质，可以利用硝化细菌等微生物以及浮萍等水生植物对水质进行修复^[1,2]。

浮萍为小型水生漂浮植物，生长速度较快并且分布广泛，大量生长在河水、江水以及湖泊中。经研究发现，浮萍可以吸收水体中的营养元素、有机物以及重金属，同时可以被回收利用，并且浮萍可以应用于不同的废水处理^[1,3]。本实验的主要研究对象为紫萍（Spirodela polyrhiza），它是漂浮植物的一类，漂浮在水面上^[4]。当阳光充足时，与其他水生植物相比有很大的优势生长优势，正是由于这一特点，在污水中不易死亡并且繁殖快，从而通过一系列生理作用，大量利用营养化水体中的营养元素，可以使水质透明，从而净化水体^[5,6]。

浮萍能够吸收氮源（NH₄ 或者NO₃^-）^[7]。下面简单叙述一下浮萍体内的氮代谢机理（如下图1所示）：在胞液中，硝酸盐可以通过硝酸还原酶（NR）转变成亚硝酸盐，通过亚硝酸盐转运体从胞液进入叶绿体基质中，经亚硝酸还原酶（NiR）的催化进一步转变成氨氮，还可以通过蛋白降解、光呼吸作用、液泡储存以及固氮作用产生氨根离子。在胞质内氨氮可进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循环（又名GS/GOGAT循环）。在谷氨酰胺合成酶(GS2)的催化下将NH₄ 和谷氨酸转变成谷氨酰胺，其催化产物再与α-酮戊二酸反应转变为谷氨酸，谷氨酸在谷氨酸合酶(GOGAT)的参与下产生两分子的谷氨酸，一个谷氨酸作为GS2的底物，另外一个则进入氨基酸代谢，从而产生蛋氨酸、精氨酸、组氨酸等等。胞液中的NH₄ 可通过GS1或者GS3的催化，将NH₄ 与谷氨酸转变成谷氨酰胺（如下图1所示）^[8,9]。

综上所述，GS/GOGAT循环同化的关键酶是谷氨酰胺合成酶（GS）以及谷氨酸合酶（GOGAT），其主要作用为把无机氮转化为有机氮^[8,10]。

图1氮在浮萍体内的代谢途径

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