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摘 要

次生休眠是指不休眠的种子或解除休眠后的种子在遇到逆境条件（干旱、高温、低氧等）时重新获得休眠的能力。油菜种子表现出不同程度的次生休眠能力。次生休眠的种子能够在地下长期存活，形成地下种子库。一旦外界环境适宜，次生休眠的种子即会萌发形成自生苗，通过异花授粉造成基因漂流，从而引发品种混杂、品质降低、生物安全等诸多问题。拟南芥MFT基因参与种子休眠过程，但油菜中BnaMFT基因的功能还未见报道。本研究利用分子生物学手段克隆了BnaMFT基因，并连入含有GFP基因的双元载体中；通过恒定转化拟南芥的手段，获得表达BnaMFT-GFP融合蛋白的转基因植株；利用共聚焦荧光显微镜，发现BnaMFT蛋白特异性地定位于细胞核中。这为研究BnaMFT基因功能奠定了重要基础。

关键词：油菜，MFT基因，亚细胞定位，自生苗

Abstract: Secondary dormancy is defined as the inability to germinate of the viable seeds under adverse conditions (i.e. drought, high temperature, hypoxia). Brassica napus seeds exhibits phenotypic variation in secondary dormancy. The secondary dormant seeds can kept alive for ten years or even longer in the soil seed bank. Once the environment is proper, the secondary dormant seeds will germinate and the seedlings will emerge as volunteer plants. The volunteers will cause genetic contamination, quality decrease and biosafty issues by cross-pollination. MFT controls seed dormancy in Arabidopsis, but the function of BnaMFT is unknown. In this study, we cloned BnaMFT gene by molecular biological techniques and introduced it into the binary vector pCAMBIA1300 (35S::GFP). And then, we screened the transgenic plants expressing BnaMFT-GFP protein by genetic transformation into Arabidopsis. We observed BnaMFT exclusively localized in the nucleus of Arabidopsis root by confocal. This result lay solid foundation for the role investigation of BnaMFT.

Key words: Brassica napus, MFT gene, subcellular localization, volunteer plants

目录

1. 前言 6

1.1 油菜简介 6

1.2 油菜次生休眠的研究进展 6

1.3 MFT基因背景介绍 8

2. 实验材料与方法 9

2.1实验材料 9

2.2 BnaMFT基因的克隆 9

2.2.1总RNA的提取 9

2.2.2 反转录 9

2.2.3 BnaMFT基因的PCR 10

2.3 重组载体的构建 10

2.3.1目的片段及表达载体的酶切与连接 10

2.3.2克隆载体的PCR鉴定 10

2.3.3 碱裂解法提取质粒 11

2.3.4农杆菌介导的拟南芥转化 11

2.3.5转基因阳性植株筛选 12

2.5 亚细胞定位 12

3.结果 13

3.1目的基因的获取 13

3.2重组载体的构建与鉴定 14

3.3 BnaMFT蛋白的亚细胞定位 16

结语 18

参考文献 19

致谢 22

前言

1.1 油菜简介

油菜（Brassica napus），又名油白菜，苦菜，十字花科、芸薹属植物。油菜作为人类重要的油料作物，有着十分巨大的应用价值，在我国的长江、黄淮流域广泛普及。我国近年食用油的总消费量中有一半来自于油菜，且工业中用油的需求量也在不断的提升^【1】。此外，油菜还存在着一定的药用价值，富含多种营养素，所含维生素c的含量十分丰富，且在中药中具有清热解毒，祛风泻火，清热消肿的作用。因此油菜有着十分巨大的发展潜力。

根据油菜的外形分类，大体上可分为三类：白菜型油菜、荠菜型油菜和甘蓝型油菜。在我国油菜栽培品种中，甘蓝型油菜居于绝大多数，占有率高达90%以上，与此同时，芥菜型油菜和白菜型油菜也均有大规模的种植。白菜型油菜，主要栽培品种有南方矮油菜以及北方小油菜等，多产于长江流域、西北部及中亚区域。该油菜品种根群发达，主根略膨大，且分根较多，叶色一般为淡绿或绿色，叶子边缘常显锯齿状，叶形包括半圆形、卵圆形、心脏形等。种子颜色多为褐色、黄色等，大小不一，含油量中等且抗病能力弱、稳定性较差。荠菜型油菜，统称为高油菜或苦油菜，原产于我国西部及西北部。该油菜品种主根入土较深，主根不膨大，侧、支根较少，叶色多显青绿、油绿色，也常带紫色，叶面密被茸毛，叶缘锯齿细而深、呈琴状或羽状缺裂，角果较细短，籽粒较小，种子颜色常见的有红、黄、褐色等，表皮有网纹。该品种油菜抗旱、抗寒、耐瘠，适应能力强，但含油量少，增产潜力弱，只适于高山区种植。甘蓝型油菜作为油菜品种中主要的油料作物，来自于欧洲和日本，其种子含油量高，高达50%以上。抗寒、耐湿，产油量高且稳定，极具潜力，大多数地区均适合种植。该油菜品种外型中等或高大，根系十分发达，叶子的颜色类似甘蓝，呈蓝绿色，花瓣为黄色，开花时会重叠，叶形椭圆，边缘不具有琴状残缺，种子为黑褐色或黑色，粒大饱满。

1.2 油菜次生休眠的研究进展

鉴于油菜在我国油料作物中占有的重要地位，我国很多的油菜育种者在为培育出高品质油菜做着努力。油菜培育的主要原则有高产、优质、抗逆和高效四大原则。高产，即利用植株的杂种优势、综合性状及产量构成因素的改良，改善基因型和环境的互作，从而提高品种的稳定性和适应性，提高油的产量。优质，即提高油的品质，比如改变氨基酸的构成及比例或除去成分中的抗营养部分等。抗逆，即提高生物抵抗逆境环境的能力，如草害、虫害、鸟害、病害等生物逆境，或缺水、温度、环境污染等非生物逆境。高效，即提高植株对于养分的吸收利用以及适应机械法放大生产的能力。休眠（dormancy）是生物界中普遍存在的现象，如细菌遇逆境等会产生芽孢，部分动物的冬眠。植物种子休眠的现象同样存在，且更为普遍，更为典型。

具有生命力的种子在适宜发芽的条件下却不能萌发的现象称为休眠，种类上分为原初休眠和次生休眠。经过先前的实验证明，发现甘蓝型油菜很少或没有原初休眠^【2-3】，但其本身却极易次生休眠^【4】。该休眠机制的存在有着很大的隐患。在油菜花收获之前和收获的期间，由于荚果的破裂，大量的种子收到重力和其他外力的拖带作用分散在土壤中，损失高达每平方米10000颗种子，在缺氧、干燥、营养含量低、无光照的不利条件下，大量的种子易被诱导进入次生休眠^【5】。次生休眠的种子在土壤中的存在时间可达10年甚至更久^【6】，来年在风雨等因素的致使下，种子露出在土地表层，在适宜的环境下，种子可能会活化萌发，影响后续栽培物的生长。由于花粉的传播，转基因植物还可能导致生物安全问题。

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