论文总字数：16034字

摘 要

达托霉素是一种新型环脂肽抗生素，在体外对革兰氏阳性菌具有显著地抑制作用，包括对多种药物产生耐药性的革兰氏阳性菌。目前，鉴于临床上广泛使用的万古霉素等抗生素的耐药性问题的突出，所以提高达托霉素产量迫在眉睫。故本论文对达托霉素发酵条件优化进行探讨，获得了最优发酵条件：接种量 5%，最佳碳源 2.2%葡萄糖，最佳氮源 2.5%黄豆粉,前体癸酸添加量为0.15g/L。在该发酵条件下，达托霉素效价达到538.0mg/L，较未优化前(446.1mg/L)提高了20.6%。

关键词：达托霉素；玫瑰孢链霉菌；发酵；优化

Abstract：Daptomycin is a novel cyclic lipopeptide antibiotic that has a significant inhibitory effect on Gram-positive bacteria, including those that are resistant to multiple drugs. Nowadays, owing to the widespread used antibiotics clinically, such as vancomycin,are facing the serious problem of tolerance, it is necessary to improve the output of daptomycin. Daptomycin is the secondary metabolite of Streptomyces roseosporus. Because the production is toxic and inhibited the microorganism itself, which causes the output of daptomycin is still insufficient and unstable. Therefore, this paper will discuss optimization of fermentation conditions for daptomycin. The optimal fermentation conditions are as follows: inoculation amount 5%, the best carbon source glucose 2.2%, the best nitrogen source soybean flour 2.5%, the precursor decanoic acid amount 0.15g/L. Under the mentioned optimal fermentation conditions,the titer of daptomycin is up to 538.0mg/L, which increases 20.6% in the basis of primary fermentation conditions(446.1mg/L).

Keywords：Daptomycin; Streptomyces roseosporus ; Fermentation; Optimization

目录

1. 绪论 5

1.1 达托霉素 5

1.1.1 达托霉素的简介 5

1.1.2 达托霉素的抗菌活性 5

1.1.3 达托霉素的临床应用 6

1.1.4 达托霉素的作用机制 6

1.2 达托霉素的发酵生产 7

1.2.1 发酵温度对达托霉素发酵的影响 7

1.2.2 发酵pH对达托霉素发酵的影响 7

1.2.3 碳源对达托霉素发酵的影响 7

1.2.4 氮源对达托霉素发酵的影响 8

1.2.5 前体流加对达托霉素生成的影响 8

1.3 达托霉素含量的检测 8

1.3.1 托霉素的生物检测 8

1.3.2 达托霉素的HPLC检测法 9

1.4 课题立意 9

1.4.1 研究目的与意义 9

1.4.2 研究内容 9

2 材料与方法 10

2.1 实验仪器与试剂 10

2.1.1 实验仪器 10

2.1.2 实验试剂 10

2.2 实验用菌种 11

2.3 实验用培养基 11

2.4 实验方法 12

2.4.1 菌种的保藏方法 12

2.4.2 菌种的活化 12

2.4.3 种子的培养方法 12

2.4.4 摇瓶发酵的培养方法 12

2.4.5 生物法测定达托霉素产量 12

3. 结果与分析 14

3.1 原始菌株生长性状 14

3.2 达托霉素产量的生物检测 15

3.3 达托霉素最佳发酵条件的研究 16

3.3.1 接种量对发酵的影响 16

3.3.2 碳源对发酵的影响 16

3.3.3 氮源对发酵的影响 17

3.3.4 前体对发酵的影响 17

3.4 实验过程不足之处 19

4. 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 23

1. 绪论

1.1 达托霉素

1.1.1 达托霉素的简介

达托霉素(C₇₂H₁₀₁N₁₇O₂₆,Mw1620.67)是S. roseosporus（玫瑰孢链霉菌）发酵产生的环脂肽抗生素，它在由革兰氏阳性病原菌引起的皮肤感染上作为重要的临床治疗剂。与其他抗生素相比，例如糖肽类抗生素万古霉素和多烯大环内酯类抗生素纳他霉素，达托霉素具有肌动蛋白的钙依赖性机制，可以结合到细菌的细胞膜上，但是迄今为止仍没有被人们完全理解^[1]。它的作用方式与任何其他获得批准的抗生素不同，它可以通过扰乱细菌细胞膜多个方面的功能，从而能快速杀死革兰氏阳性细菌，这与钙和钾有关^[2]。

图1-1 抗生素达托霉素的化学结构式^[1]

达托霉素是一种新型抗生素，目前以商品名Cubicin出售，近来被美国FDA批准为可以治疗革兰氏阳性病原菌。达托霉素是环状的阴离子十三肽，具有多种D型氨基酸（D-天冬酰胺、D-丙氨酸和D-丝氨酸），三个罕见的氨基酸残基（鸟氨酸、（2S,3R）-3甲基-谷氨酸和犬鸟氨酸），以及一个酰化的带n-癸酰基脂肪酸侧链的N-末端^[3]。

1.1.2 达托霉素的抗菌活性

达托霉素被发现可以作为抑制具有甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌的有效抗菌剂，也可以抑制具有万古霉素抗性的肠球菌、青霉素抗性的链球菌和凝固酶阴性的葡萄球菌^[3]。对这些耐药菌有很好抑菌效果的抗生素选择不多，而达托霉素特殊的抑菌作用使这些抗性菌很难产生耐药性。达托霉素具有在体外抗所有革兰阳性菌的独特作用，但不作用于革兰氏阴性菌。达托霉素对于敏感株的MIC比临床上的万古霉素低4倍左右,而对MRSA和凝固酶阴性葡萄球菌的MIC90基本稳定在0.5μg/mg左右^[4]。达托霉素可产生抗生素后效应(PAE),在达托霉素浓度为0.25～16μg/mL 范围内，对金葡菌和肠球菌的PAEs 持续1～6h，对达托霉素产生自发获得性的耐药是罕见的^[5]。

1.1.3 达托霉素的临床应用

达托霉素对大多数临床相关的革兰氏阳性细菌有体外杀菌活性，包括抗性品系，例如MRSA和VRE，是一种新型脂肽抗生素。目前，达托霉素用于治疗敏感生物引起的复杂性皮肤和软组织感染以及金黄色葡萄球菌血流感染（BSIs），包括右侧心内膜炎感染的治疗。然而关于达托霉素临床上的失败和抗性品系也有所报道。因此，使用超过被批准的剂量也不失为一种选择，高剂量可以很好的利用达托霉素的药代动力学分布图和它的浓度依赖性活性。虽然在大于6mg/kg/天的剂量上的临床经验是有限的，但它已经被越来越多的使用，而且从剂量达到12mg/kg/天的健康志愿者身上证明剂量gt;6mg/kg/天是安全和耐药性良好的^[6]。达托霉素可以治疗皮肤和软组织感染、革兰阳性尿道病原菌引起的复杂尿道感染、治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌性人工瓣膜心内膜炎伴旁瓣脓肿，还有与利福平或氨苄西林的协同作用^[5]。对于革兰阳性菌引起的菌血症和心内膜炎用达托霉素治疗的Ⅲ期临床试验在2005年完成，FDA已批准达托霉素用于治疗上述两种症状^[7]。

1.1.4 达托霉素的作用机制

达托霉素的作用机制与任何目前可用的抗生素不同。它通过结合到细菌的细胞膜上，达托霉素引起了细胞壁上通道的形成，钾离子的外流导致膜电位的快速去极化。因此，膜电位的降低导致抑制了蛋白质、DNA、RNA合成，引起细菌细胞的死亡。达托霉素对大多数革兰氏阳性病原菌是有效的，包括那些对多种药物产生耐药性的革兰氏阳性菌。达托霉素在对多种药物产生耐药性的生物上表现出体外活性，包括MRSA，糖肽中间体金黄色葡萄球菌（GISA）,万古霉素抗性的金黄色葡萄球菌（VRSA）和VRE^[6]。另外，它还可以通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运, 从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成, 改变细胞质膜的性质，从而达到杀菌的目的^[5]。经达托霉素处理的金黄色葡萄球菌电镜扫描相片显示,达托霉素可以在细胞没有发生自溶的情况下迅速杀死细胞,这样就避免了因细胞磷壁酸,肽聚糖和DNA的释放而引起的炎症反应和对机体造成影响^[4]。因此达托霉素独特的作用机制使得对耐药菌有很好的治疗效果。

1.2 达托霉素的发酵生产

1.2.1 发酵温度对达托霉素发酵的影响

温度是保证各种酶活性的重要条件，微生物的生长和产物合成均需在其各自适合的温度下进行。所以，在发酵过程中必须保证稳定和最适宜的温度环境。在生长初期抗生素还未开始合成的阶段，菌体的生物量需大量积累，主要是需要促进菌丝迅速繁殖，大量积累生物量，这时应优先考虑采用菌体最适生长温度。到抗生素分泌期，菌丝已长到一定浓度，这时应优先考虑采用抗生素生物合成的最适温度。发酵温度对抗生素效价形成有较大影响，过高或过低的温度均会影响菌体的生长及酶活，从而影响达托霉素的合成。王蓓等人研究得出32℃为最佳培养温度，此时达托霉素效价达到236μg/mg^[8]。

1.2.2 发酵pH对达托霉素发酵的影响

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH通常是不一样的。这不仅与菌种特性有关，也与产物的化学性质有关。一些抗生素合成的最适pH如下：链霉素和红霉素为中性偏碱，6.8-7.4；金霉素、四环素为5.9-6.33；青霉素为6.5-6.8。在发酵过程中，pH是动态变化的，这与微生物的代谢活动及培养基性质密切相关。发酵液pH的改变将对发酵产生很大的影响。控制pH在合适的范围应首先从基础培养基的配方考虑，然后通过加酸碱或者中间补料来控制。何美儒等研究得到初始 pH 值为8.6 时，达托霉素产量达最大（269.12 mg/L）^[9]。王蓓等研究得出初始pH值为8．5时达托霉素效价最高，达到232μg/mL，pH过高或过低均不利于达托霉素的产生^[8]。

1.2.3 碳源对达托霉素发酵的影响

碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能有两个：一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；二是提供菌体合成目的产物的原料。葡萄糖是最容易利用的碳源之一，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以，葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生物生长的一种速效碳源。余继叁等用可溶性淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖、甘油、玉米粉分别作为玫瑰孢链霉菌的迟效碳源，得出分别加入2%的可溶性淀粉和2%的糊精时,玫瑰孢链霉菌NRRL11379可以合成较大量的活性物质(抑菌圈直径都为23mm),即为最佳迟效碳源^[10]。王蓓等以黄豆粉为碳源时达托霉素效价最高，达183μg/mL，因此3％的黄豆粉可作为最佳碳源^[8]。刘省伟等以糊精为碳源，达托霉素的产量最高，培养6d可达362.7mg/L^[11]。

1.2.4 氮源对达托霉素发酵的影响

氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的有机氮源有黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟等。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐、氨水等。微生物对它们的吸收利用一般较快，尤其是铵盐、氨水等比有机氮源的吸收要快得多，所以也称为速效氮源。余继叁等用2.0%的黄豆粉和0.6%的(NH₄)₂SO₄分别作为单一氮源时,为最佳氮源(抑菌圈直径都为23mm),但玫瑰孢链霉菌NRRL11379在单一的氮源下菌体生长都不好,所以在后面的优化中使用复合氮源^[10]。王蓓等采用2％的豆粕作为氮源时达托霉素效价最高^[8]。

1.2.5 前体流加对达托霉素生成的影响

ChimingYe等认为，在培养的过程中添加癸酸钠作为前体，达托霉素的产量达到32.7mg/L，这个结果与之前一些报道是一致的。但在生物量、还原糖、pH上，添加癸酸钠的一组与不加癸酸钠的一组没有明显的区别。这表明了前体癸酸钠对细胞生长的作用不大，但在玫瑰孢链霉菌发酵达托霉素的过程中至关重要。在一些研究中癸酸在达托霉素的生产中也被作为前体。结果显示与癸酸相比，癸酸钠作为前体在达托霉素的产量上优势更显著。癸酸钠是水溶性的，因此能相对高浓度较容易的被细胞吸收^[1]。前体癸酸能提供侧链，通过生物酰化作用合成目的产物达托霉素。王蓓等研究表明前体癸酸添加量为50μL时效价最高，达到289μg/mL。高浓度的癸酸在一定程度上对菌体的生长产生了抑制作用，甚至会产生一定的毒副作用，低浓度的癸酸由于量太少，不能形成足够的侧链，从而使达托霉素合成量降低^[8]。达托霉素的发酵过程包括菌体生长和次级代谢产物合成两个阶段，过早添加前体癸酸不利于菌体生长，过迟添加就会不利于达托霉素的大量合成。因此，选择在菌体生长后期、次级代谢产物合成初期 ( 即发酵 48 h 后 )添加前体癸酸更利于达托霉素的大量合成^[12]。

1.3 达托霉素含量的检测

1.3.1 托霉素的生物检测

抗生素的抗菌特性决定了它的医疗价值，因此，利用它们各自的抗菌活性来测定其效价有着重要的意义。国际上最常用的是杯碟扩散法，基本原理为：测定时，将规格完全一致的牛津小杯置于含敏感菌的琼脂平板上，在牛津小杯中加入已知浓度的标准品和未知浓度的样品发酵液，结果抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌圈。测量抑菌圈的直径，可以得到抑菌圈面积与抗生素浓度的线性关系，从而测定其效价。达托霉素是一种抗生素，可以采用此方法检测其效价。

1.3.2 达托霉素的HPLC检测法

I-Son Ng等检测达托霉素浓度，用Sunfire-C18反向柱子，流动相为0.1%三氟乙酸：乙腈（55：45），流速为1.0mL/min，波长为218nm,温度为30℃^[2]。祝宇松等用HPLC检测发酵液含量，色谱条件 ：色谱柱 HanBon C18柱 (4.6 mm×150 mm，3µm) ；流动相 乙腈 ( 含0.1％三氟乙酸 )-0.1％三氟乙酸水溶液 (41︰59) ；流速 1.0 mL/min ；检测波长 223 nm ；柱温 35 ℃ ；进样量 20 µL^[13]。余继叁等用DIONEX高效液相色谱仪(美国戴安公司)对达托霉素产量进行测定,色谱条件为:色谱柱ShimadzuVP-ODS,(250.0 mm×4.6 mm,5.0μm),流速1.0 ml/min,检测波长223 nm^[10]。宇光海等对达托霉素进行HPLC检测时，分析柱为反相ODS柱，流动相为含0.1%三氟乙酸的乙腈-水（45.5∶54.5，体积比），流速1mL·min^﹣1，柱温30℃，柱压8-9MPa，检测波长220nm^[14]。吴远杰等测定发酵单位，色谱柱 Hypersil ODS2 C₁₈柱 (4.6 mm×150 mm，5μm) ；流动相 0.1 mol/L 磷酸二氢钠溶液 (A)-50％乙腈 (B)，梯度洗脱(0→17.0 min，A﹕B=50﹕50→0﹕100)；流速 1.0 ml/min ；检测波长 223 nm ；柱温 30 ℃ ；进样量 40μL^[12]。

1.4 课题立意

1.4.1 研究目的与意义

临床上应用广泛的治疗革兰氏阳性病原菌的抗生素，如万古霉素等的耐药性问题的日益突出，使得寻求新型抗生素的成为需要。达托霉素是一种新型的环脂肽抗生素，在体外具有抑制所有革兰氏阳性菌的活性，甚至是耐多种药物的病原菌，如MRSA等。达托霉素独特的抗菌机制使得病原菌很难产生耐药性，所以临床上对达托霉素需求很大。然而，达托霉素的结构复杂化学全合成困难较多，微生物发酵生产达托霉素是目前唯一的方法^[15]。所以优化达托霉素发酵条件，从而得到达托霉素的最优发酵条件，这对临床上解决达托霉素量不足有很好的帮助。

1.4.2 研究内容

1. 本论文从达托霉素的抗菌活性、临床应用、作用机制、发酵条件等生物属性对达托霉素进行综合性的论述，从而对达托霉素有个全面认识；
2. 通过查阅文献对达托霉素的发酵条件有基本了解后，从接种量、不同碳源、不同氮源、不同前体方面对达托霉素最优发酵条件进行了探讨，单因素比较达托霉素效价，得出达托霉素最优发酵条件。

2 材料与方法

2.1 实验仪器与试剂

2.1.1 实验仪器

仪器名称和型号 生产厂家

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A型） 上海精宏实验设备有限公司

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