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摘 要

对大肠杆菌glgB 基因进行PCR扩增后，将PCR 产物连接到克隆载体pUC19上即得到重组质粒pUC19-glgB。然后将重组质粒pUC19-glgB的glgB基因片段插入到含有GBSSIpro 和 GBSSItp 序列的pUC19/SBD2 质粒的相应酶切位点中即得到了中间载体质粒 pUC19-GBSSIpro-GBSSItp-glgB，最后将含有glgB基因片段插入到植物表达载体pBIN19/SBD2的相应酶切位点中即得到了植物表达载体pBIN19-glgB。将植物表达载体pBIN19-glgB通过电激转化法导入根瘤农杆菌 EHA105中，通过根癌农杆菌介导的方法将pBIN19-glgB转入马铃薯中，并对马铃薯转基因植株进行PCR检测，结果表明glgB基因已经整合到马铃薯基因组中。

关键词:glgB 基因，植物表达载体，PCR检测，转基因马铃薯

Abstract: The glgB gene of E.coli was amplified by PCR and inserted into cloning vector pUC19 to generate recombinant plasmid pUC19-glgB. Then the glgB gene derived from plasmid pUC19-glgB was inserted into the corresponding restriction sites of the plasmid pUC19/SBD2 which already contained the GBSSI promoter and GBSSI transit peptide sequence to get intermediate plasmid pUC19-GBSSIpro-GBSSItp-glgB. Next, the gene fragment containing glgB was inserted into corresponding restriction sites of the plant expression vector pBIN19/SBD2. The pBIN19-glgB was transferred into Agrobacterium EHA105 by electroporation. The pBIN19-glgB was transferred into the potato by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. PCR identification of transgenic potato plants indicated that the glgB gene has been integrated into potato genome.

Key words: glgB gene, plant expression vector, PCR identification, transgenic potatoes

目 录

1 前言 4

2 材料与方法 4

2.1 材料 4

2.2 方法 5

3 结果与分析 9

3.1 糖原分支酶基因(glgB)的PCR 扩增 9

3.2 重组质粒pUC19-glgB的酶切鉴定 9

3.3 中间载体pUC19-GBSSIpro-GBSSItp-glgB的酶切鉴定 10

3.4 植物表达载体pBIN19-glgB的酶切鉴定 11

3.5 植物表达载体pBIN19-glgB 转化农杆菌EHA105 11

3.6 马铃薯转基因植株的PCR检测 12

结论 13

参考文献 14

致 谢 15

1 前言

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是一种分布广泛、适应性强、产量高、营养丰富的粮食兼经济作物,其产量仅次于水稻、小麦和玉米,居第四位。马铃薯为同源四倍体作物，遗传分离复杂，后代筛选烦琐，许多野生种与栽培种之间存在有性杂交不亲和现象，且病毒易通过无性繁殖逐代积累，品种退化严重^[1]。由于常规育种方法进行马铃薯育种需要的时间长、困难大，因此利用基因工程技术提高马铃薯产量和品质是一种行之有效的方法。

农杆菌介导的遗传转化方法因具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化体的特点而成为马铃薯常用的外源基因转移方法。自1983年第一例农杆菌介导的转基因马铃薯问世以来，马铃薯遗传转化系统日趋成熟，但仍存在基因型依赖性问题^[2,3]、转化率较低、重复性不强等问题。为了获得高效的转化效率，必须在前人研究的基础上继续研究影响马铃薯遗传转化效率的因素，并尽可能根据实际情况优化遗传转化体系，目前关于马铃薯Desiree 品种的遗传转化已有报道^[4,5]。

本实验构建了含有glgB基因的植物表达载体pBIN19-glgB，然后将植物表达载体pBIN19-glgB通过电激转化法导入根瘤农杆菌 EHA105中。通过根癌农杆菌介导的方法将pBIN19-glgB转入马铃薯中，并对马铃薯转基因植株进行PCR检测，最终获得了马铃薯转基因植株。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 质粒与菌株

克隆载体pUC19、大肠杆菌E.coli DH5α购自TaKaRa公司；中间载体pUC19/SBD2、植物表达载体pBIN19/SBD2、根瘤农杆菌菌株EHA105 (具有利福平抗性)为本实验室保存。

2.1.2 酶与试剂

Pfu DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、各种限制性内切酶、DNA marker、卡那霉素、氨苄青霉素、利福平购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Promega 公司；PCR 引物合成和基因测序由上海生工生物工程公司完成；其它试剂为进口或国产分析纯。

2.1.3　植物材料

以马铃薯栽培品种Desiree的无菌苗为植物材料，取苗龄3周的生长状态良好的无菌苗茎段为转化的受体材料。

2.1.4 培养基

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