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摘 要

本文通过对校园土壤内碱性蛋白酶的产生菌的筛选进行研究。根据产酶鉴别培养基上产生蛋白酶水解圈的大小对所筛选的菌株的碱性蛋白酶产生能力的大小进行判断，选出产生碱性蛋白酶能力较强的菌株进行分类鉴定，在研究该菌株的形态特征、运动性、培养特征和生理生化特征等基础上，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌细胞杆状，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性，为严格好氧菌。

 

 

关键词：碱性蛋白酶，鉴定，枯草芽孢杆菌，生理生化鉴定

Abstract：The selection of bacteria producing alkaline protease in soil was researched in this article. Judging the capability of the alkaline protease of the screened bacterial strains according to the sizes of protease hydrolyzed circles generated on a culture medium with produced enzyme, this paper had selected and identified bacterial strains with stronger ability to generate alkaline protease and preliminarily identified them as Bacillus subtilis according to morphological characteristics, motility, cultural characteristics, physiological characteristics and biochemical characteristics of the bacterial strains. Cells of such bacteria were rod-shaped and there was no bacterial capsule around the bacteria, moreover, flagella were growing around them and they could move, they were gram-positive and strict aerobic bacteria.

 

 

Key words: alkaline protease, identification, Bacillus subtilis, physiological and biochemical identification

 

 

 

 

 

 

 

 

 

目 录

1 前言 4

1.1 碱性蛋白酶的理化特性 4

1.2 微生物碱性蛋白酶的产生菌 4

1.3 碱性蛋白酶在我国的研究状况 4

1.4 碱性蛋白酶的应用 5

1.5 碱性蛋白酶研究的前景 5

2 材料和方法 6

2.1 实验材料与仪器 6

2.1.1 样品采集 6

2.1.2 设备与仪器 6

2.1.3 试剂 6

2.2 培养基及常用溶液配制 7

2.3 溶液配制 8

3 实验方法 9

3.1 制备土壤稀释液 9

3.2 涂布和培养 9

3.3 观察与保存 9

3.4 产碱性蛋白酶菌株的筛选 9

3.5 酶活力的测定 10

3.6 菌株的生理生化鉴定 10

3.6.1 革兰氏染色 10

3.6.2 菌株形态鉴定 10

3.6.3 菌株生理生化鉴定 10

4 结果与讨论 11

4.1 培养出的细菌 11

4.2 产碱性蛋白酶菌株的筛选 12

4.3 菌株S的酶活力 12

4.4 菌株S的生理生化鉴定 12

4.4.1 革兰氏染色 12

4.4.2 菌株S形态鉴定 13

4.4.3 菌株S生理生化鉴定 13

4.5 讨论 14

结论 15

参 考 文 献 16

致 谢 18

 

 

1 前言

1.1 碱性蛋白酶的理化特性

碱性蛋白酶是一类最适pH为碱性的蛋白酶类，一般最适pH值为9-10^[1]，由于其活性中心含丝氨酸，故属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，它不但具有水解肽键的能力，还具备水解酯键，酰胺键和转酯及转肽的功能。由于缺少半胱氨酸形成二硫键，故能被来自大麦、大豆、马铃薯的蛋白酶抑制剂所抑制，由于钙离子对此酶有一定的稳定作用，苯甲磺酰氟和其他磺酰卤化物可引起碱性蛋白酶失活，并且，由于碱性蛋白酶本身的活性中心含有丝氨酸，这一特征决定了当碱性蛋白酶遇到作用于丝氨酸的试剂便可失活。

1.2 微生物碱性蛋白酶的产生菌

现代社会对微生物碱性蛋白酶的研究越来越广泛。经研究发现，碱性蛋白酶主要来源于几种芽孢杆菌，例如：枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，短小芽孢杆菌以及嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，灰色链霉菌、费氏链霉菌和某些镰刀菌、霉菌也能产生碱性蛋白酶^[2]。

1.3 碱性蛋白酶在我国的研究状况

我国生产的菌种主要有地衣芽孢杆菌2709、短小芽孢杆菌289和209菌株。由于我国的碱性蛋白酶的研究比国外落后，所以，现在我国对碱性蛋白酶的研究技术主要有以下几种：传统的诱变技术（包括原生质体诱变）、基因工程、蛋白质工程、孢子熟处理等。

利用物理的、化学的诱变剂单独或复合处理微生物细胞（还有原生质体）而选育出高产或变种的碱性蛋白酶产生菌的方法叫传统诱变技术^{[3, 4]}。基因工程就是DNA体外重组技术，DNA重组技术是通过质粒-宿主系统而将碱性蛋白酶基因克隆、表达的一门技术，也就是在分子水平上直接操作DNA，将某种生物的蛋白酶基因转移到另一种生物细胞中，使蛋白酶基因在新细胞中扩增和表达。而蛋白质工程是指通过对天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构基因的改造从而达到修饰蛋白质分子结构，以致改变蛋白质性能甚至创造自然界中尚未发现的新的蛋白质^[5]。孢子热处理则是将菌体（或是孢子、原生质体)在高温下热处理一定时间后，使低温菌淘汰而高温菌纯化，连续交替多次处理从而获得耐高温菌种的一种方法，可以通过这种方法获得耐高温的碱性蛋白酶^{[1, 3]}。

近些年来通过我国科学研究者对碱性蛋白酶生产的研究与探讨，国内碱性蛋白酶的研究水平有了很大的提高。例如邱秀宝等人从土壤中筛选到的嗜碱性的短小芽抱杆菌R₁₁₅，然后通过选育获得一株碱性蛋白酶变异株B₄₅，此菌株具有高产稳产的性能，可以通过发酵条件研究使其酶活力达18000U/ml，此酶活力已经达到全国最高水平^{[6, 7]}；徐子渊等人通过把原碱性蛋白酶生产菌2709进行诱变育种，使其产生变异株C₁₂₁₃，这样的变化让酶产量提高了近40%^[8]；冯清平等人从土样中筛选到一株嗜碱性的地衣芽抱杆菌53-A₆，通过复合诱变处理其原生质体，从中选育出了耐碱、耐高温的碱性蛋白酶的高产菌株^{[1, 9, 10]}，可以应用于工业生产过程中。

1.4 碱性蛋白酶的应用

碱性蛋白酶应用广泛，在洗涤剂、饲料、医药、食品、制革、丝绸、环保等领域都有广泛的应用，在世界范围内，碱性蛋白酶的产量占酶制剂总产量的40%左右，具有重要的工业和经济价值^[11]。以下是碱性蛋白酶的一些应用^[12]：

1）在洗涤剂中的应用：主要用于加酶洗衣粉，可以去除血、奶等的蛋白污垢，并且能够减少含磷化合物的使用量，减轻环境污染的许多问题。

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