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摘 要

水稻cystatin家族属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。为了解cystatin基因在水稻中的结构和功能，采用生物信息学方法鉴定出11个水稻cystatin基因，并对其进行了系统发育和表达分析。结果表明，该家族蛋白质可分为3个亚组，说明其成员已经发生了分化；在系统发育树的末端发现了2对旁系同源基因，说明水稻cystatin家族以物种特异的方式进行扩增。EST表达分析表明，3个OsCYS基因为不表达的假基因，5个基因在花、叶、根、愈伤组织等器官中呈组成型表达，3个基因在花或愈伤组织中特异性表达。此外，部分OsCYS基因的表达受到植物激素的调控。这些结果为水稻cystatin基因的功能分析奠定了基础。

关键词：水稻，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，进化分析，表达分析

Abstract: Rice cystatin family belongs to cysteine proteinase inhibitor families. To understand the structure and function of cystatin genes in rice, 11 genes were identified using bioinformatics approaches and their phylogenetic relationships and expression patterns were investigated. Phylogenetic analysis divided rice cystatin proteins into three subgroups, suggesting that divergence has occurred among this family; two pairs of paralogous genes were identified at the end of the phylogenetic tree, indicating that species-specific expansion contributed to the evolution of this family in rice. Expression analysis using EST data showed that three OsCYS genes are pseudogenes, five are constitutively expressed in flowers, leaves, roots, callus and other organs, and three are specifically expressed in flowers or callus. These results will lay a solid foundation for functional analysis of rice cystatin genes.

Keywords: rice, cysteine protease inhibitor, evolutionary analysis, expression analysis

目 录

1 前言 6

2 材料与方法 6

2.1序列检索和基因复制分析 6

2.2多序列对比和系统发育分析 7

2.3 EST表达分析 7

2.4 植物激素处理下的表达分析 7

3 结果分析 7

3.1水稻中的cystatin基因家族 7

3.2 水稻cystatin基因家族的染色体分布 8

3.3 水稻cystatin蛋白的系统发育分析 8

3.4 水稻cystatin基因家族的EST表达分析 9

3.5 水稻cystatin基因激素处理下的表达分析 10

讨论 11

参 考 文 献 12

致 谢 14

1 前言

蛋白酶抑制剂（Proteinase Inhitor，PI）是指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，降低蛋白酶的活力，调节蛋白代谢和各种蛋白酶活性的一类蛋白质。PI在水稻^[1]、拟南芥^[2]、玉米^[3]、豌豆^[4]、大麦^[5]、小麦^[6]等植物中都广泛存在，能够抑制某些病源微生物的生长，是植物的一种自然防御体系^[7]。根据其类型的不同可以分为四种：半胱氨酸类蛋白酶抑制剂、天冬氨酸类蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂^[8]。Anastasi等^[9]首次采用亲和层析法从鸡蛋中分离得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂并命名为“cystatin”，此后cystatin在不同的植物中也被分离纯化。研究植物中蛋白酶抑制剂的表达有利于了解其生理功能及基因工程研究。

水稻是最重要的粮食作物之一，基因组较小，是单子叶植物基因组研究的模式植物。它分为籼稻和粳稻两个亚种，这两个亚种的全基因组序列相继测序完成，并已经进行了深入的诠释，能更好的在基因组水平上来研究基因家族的特征 ^[10]。水稻cystatin基因能对鞘翅目昆虫表现出强烈的抗性，可以抑制稻瘟病菌丝体的生长^[11]。Martinez等^[11]对水稻cystatin家族进行了系统鉴定，但他们没有对检出的cystatin序列进行cystatin结构域分析，可能含有非cystatin家族成员。本研究利用已经有的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因所编码的蛋白序列，找到其相似的序列，并通过预测候选蛋白的cystatin结构域，确定水稻中所有的cystatin基因；通过生物信息学的方法，对水稻中的cystatin蛋白质构建系统发育树，分析这一家族基因所编码蛋白质的保守序列；此外通过EST和芯片数据库检索来分析该家族基因的组织器官和激素处理下表达特征，这为进一步分离和植物基因克隆奠定基础。

2 材料与方法

2.1 序列检索和基因复制分析

利用cystatin蛋白已知结构域序列在RGAP比对搜索，在水稻的注释蛋白质库中寻找相似的蛋白序列，当E≤0.1的序列时则被认为是候选蛋白，再将候选蛋白的序列在Pfam中检测，若存在cystatin结构域，则认为该候选蛋白属于cystatin蛋白家族，若未能检测出来，则认为其不属于该家族。获取水稻cystatin基因信息后，从RGAP中下载每一条记录的基因序列、蛋白质序列、CDS序列，获得每一条记录的外显子数、蛋白质氨基酸数、转录方向。

Cystatin基因在染色体上的位置图通过MapChart软件绘制并手工编辑。通过Plant Genome Duplication Database（PGDD, http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus）找cystatin基因的复制事件。

2.2 多序列对比和系统发育分析

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