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摘 要

：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，本文以水稻为研究材料，分别使用定性和定量PCR进行分析检测。判断水稻样品中是否含有目标基因NPTⅡ。

关键词：水稻 外源基因 PCR技术

Abstract: Transgenic plants gene copy number is influence gene expression level and genetic stability factors, this paper used rice as research materials, respectively using qualitative and quantitative PCR analysis and detection. To determine whether the rice sample contained target gene NPT II.

Keywords: rice foreign gene PCR

目 录

1前言 4

2 材料与方法 4

2.1 材料 4

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 5

2.4 方法 5

2.4.1 DNA的提取与纯化 5

2.4.2引物序列 6

2.4.3 PCR检测 6

3结果分析 7

3.1 定性PCR检测 7

3.2荧光定量PCR检测 8

结论 10

参考文献 11

致谢 12

1前言

随着基因工程技术的迅速发展，转基因技术也日趋成熟，商品化生产的转基因生物产品也就越来越多。目前，种植的转基因作物主要是玉米、棉花、水稻和大豆等，水稻是世界上主要的粮食作物之一^[1]，近年来世界范围内出现了严重的粮食危机。杂交水稻增产有限，而转基因水稻可以大幅度提高水稻产量。

然而用于创造转基因植物的技术并不准确，在转基因操作过程当中，多个拷贝的外源基因或基因片断会随机地插入作物原有的基因当中，造成原有基因的缺失或重排。转入基因的表达产物是否有毒性或致敏性，也对转基因食品的安全造成很大影响。

目前，转基因生物检测技术主要分为两大类，一类是基于蛋白质检测的蛋白检测技术，另一类是基于核酸检测的检测技术^[2]。由于DNA的稳定性，基于核酸的检测技术几乎适合所有种类的样品。

PCR是聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)的简称。是利用核酸复制酶、引物和核酸单体组成元件，在试管内完成模板DNA的复制。PCR技术有特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好等优点^[3]。转基因产品定性PCR检测方法可以判断待检样品中是否含有外源基因。

随着分子生物学技术的发展，近年来逐渐发展的实时荧光定量PCR 技术，不仅提高了检测的准确性和灵敏度，而且该方法对PCR 产物不需要进行后期处理，这大大减少了交叉污染的形成，克服了普通PCR存在假阳性以及不能进行精确定量的缺点，同时也提高了检测速度^[4]。

NPTⅡ是植物遗传转化中最常用的筛选标记基因之一，来自大肠杆菌转座子Tn5上的APHⅡ基因，编码新霉素磷酸转移酶。NPTⅡ可使ATP分子上的γ磷酸基转移到抗生素分子上，从而影响抗生素与核糖体亚基的结合，使氨基糖苷类抗生素(如G418、卡那霉素、巴龙霉素和新霉素等)因磷酸化而失活^[5,6]。本研究主要以水稻为材料，分别采取定性及定量PCR技术，对待测样品进行检测分析。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有NPTⅡ基因），待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

实验步骤如下：

（1）将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。

（2）65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。

（3）加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。

（4）将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。

（5）将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。

（6）加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。

（7）将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完 溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

（8）向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（9）重复步骤8。

（10）12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

（11）将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物，引物序列详见下表。

2.4.3 PCR检测

（1）定性PCR扩增

PCR技术是一种体外扩增技术，在引物、模板DNA和C、G、A、T核苷酸存在的条件下，进行的聚合酶的酶促反应，通过酶促反应，使DNA片段在数量上呈指数增加的技术，使用该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下：

按照上述反应体系设两个对照实验。以含有目标基因的质粒作阳性对照，以水作空白对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物退火温度及扩增片段的大小设定扩增反应条件，详见表4。

PCR反应结束后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析使用的为1%的琼脂糖胶，将1%的琼脂糖在电泳液中充分溶解后制胶，待胶凝固后取5ul待检测的PCR产物置于点样孔中，以Super Maker做分子量标记，在180V电压下恒压电泳30分钟，电泳结束后将琼脂糖胶置于EB染液中进行染色3分钟，然后用清水缓慢冲洗凝胶5分钟，以便洗去表面的EB染料，将清洗后的凝胶置于凝胶成像系统观察。

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