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摘 要

随着基因工程技术的研究和发展，转基因农产品的市场化趋势已越来越明显，国家也采取相应措施对转基因产品加以管理。目前对转基因产品外源基因的检测多集中在启动子、终止子、目标基因和标记基因上，本文以转基因水稻为研究材料，通过使用常用的PCR技术对待测样品进行定性和定量检测分析，从而判断该待测样品中是否含有目标基因。

关键词： 水稻 转基因 定性检测 定量检测

Abstract: Rising of genetically engineered technology, the market trend of Transgenic Agricultural Products has become more and more obvious, the country also take corresponding measures to regulate genetically modified products. At present the detection of transgenic products of exogenous genes and more concentrated in the promoter, terminator, and target gene and marker gene. In this paper, transgenic rice was used as research materials. We made a qualitative and quantitative detection by using fluorescent PCR technology commonly used in the sample to be measured, and thus the sample to be measured is the presence of the exogenous gene of qualitative and quantitative analysis.

Keywords: Rice, Transgenic, Qualitative detection, Quantitative detection

目录

1 前言 4

2 材料与方法 4

2.1 材料 4

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 5

2.4方法 5

2.4.1 DNA的提取与纯化 5

2.4.2 引物序列 5

2.4.3 PCR 检测 6

3 结果分析 7

3.1定性PCR检测 8

3.2荧光定量PCR检测 8

结论 ...10

参考文献 11

致谢 12

1 前言

自1983年世界上首例转基因作物--转基因烟草问世以来，转基因作物已获得了长足发展。到目前为止，全世界已有25个国家开始转基因农作物的种植，世界各国已试种的转基因植物超过4500种，已批准商业化种植的转基因品系已超过100余种^[1]。不久前，ISAAA在北京公布最新全球年度生物技术作物种植面积报告。报告显示，目前有1800多万农民在1.75亿公顷的土地上种植生物技术作物。

目前，玉米、水稻等是主要种植的转基因作物，水稻作为主要粮食作物之一，近年来出现了大面积的粮食危机，而杂交水稻的增产又十分有限，但是，转基因水稻却能够大幅度提高产量。现在已有LLRICE62等多个品系的转基因水稻商品化^[2]，而我国也已经育成具抗虫基因 (如Bt和CpTI基因)、抗病基因(Xa21)和抗除草剂基因(bar，EPSPS)等转基因水稻品系，它们的商品化生产正等待着国家的批准^[3]。

随着转基因产业的迅速发展，转基因产品的安全性问题一直是国内外关注的焦点，它直接关系到人类的健康和生态环境安全，并且对国际贸易造成了一定影响，有关组织对此也表示极大的关注。为了加强转基因产品的管理，世界各国均已出台了相关管理办法。目前对转基因产品标识国大都有标识低限(阈值)，如欧盟的1％、韩国3％、日本5％^[4-6]，而对未经批准的转基因产品则采取零阈值处理。

目前，转基因生物检测技术主要分为两大类，一类是基于蛋白质检测的检测技术，另一类是基于核酸检测的检测技术^[7]。PCR是聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)的简称,是利用核酸复制酶、引物和核酸单体组成，在试管内完成模板DNA复制的一种简便、快速、灵敏的定性检测法，是首选的检测方法。PCR技术几乎能检测所有种类的转基因产品，不受蛋白质表达的影响，且具有较高的灵敏度。

HPTⅡ基因(新霉素磷酸转移酶基因)主要来源于大肠杆菌Tn5转座子的基因，其广泛用作双子叶植物转基因的选择标记基因，对茄科植物如烟草、马铃薯和番茄等特别有效。在水稻、玉米、小麦及甘蔗等作物中也得到了成功的应用^[8]。

本次研究以水稻品系为试验材料，采用定性及定量PCR方法检测水稻是否含有外源转基因成分。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有HPTⅡ基因），待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

实验步骤如下：

1. 将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。
2. 65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。
3. 加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。
4. 将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。
5. 将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。
6. 加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。
7. 将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完 溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 重复步骤8。
10. 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
11. 将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2 引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物和探针，引物及探针序列详见表1和2。

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