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摘 要

转基因作物潜在的安全性问题引起了人们的广泛关注，各国相继出台了相关的转基因标识管理法规，因此，作为转基因产品安全检测的研究显得尤为重要。本文通过使用常用的水稻外源基因Cry1Ab/c对待测样品进行定性和定量检测，从而对待测样品是否含有该外源基因进行定性及定量分析。

关键词：水稻；外源基因Cry1Ab/c；定性PCR；定量PCR

Abstract: The safety problem of transgenic crop potential has aroused widespread concern, countries have introduced transgenic labeling management regulations, so as to study related, safety detection of genetically modified products is very important. In this paper, by using the rice exogenous gene of Cry1Ab/c commonly used for qualitative and quantitative detection of sample to be measured, and thus the sample to be measured is the presence of the exogenous gene of qualitative and quantitative analysis.

Key word: Rice; Cry1Ab/c gene; qualitative PCR; quantitative PCR

目 录

1 前言 5

2 材料与方法 6

2.1 材料 6

2.2试剂与耗材 6

2.3 仪器与设备 6

2.4 方法 6

2.4.1 DNA的提取与纯化 7

2.4.2 引物序列 7

2.4.3 PCR 检测 7

3 结果分析 8

3.1定性PCR检测 9

3.2 实时荧光定量PCR检测 9

结论 10

参考文献 12

致谢 13

1 前言

自1994年首例转基因番茄被批准商业化生产以来，转基因技术获得了迅猛发展，越来越多的外源基因被导入到植株中，形成转基因植物，与此同时，转基因作物也在不同国家和地区被批准商业化种植^[1]，目前种植的主要转基因作物分别为转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米和转基因油菜。

目前有许多抗病、抗虫、耐除草剂的转基因水稻研发成功，但是，由于水稻是主要的粮食作物，而转基因水稻在生物安全性方面存在不确定因素，因此，关于转基因水稻的商业化各国的态度都非常谨慎，现在已经商业化的转基因水稻很少。在这种背景下， 我国转基因水稻也得到了迅速发展，2009年，我国农业部颁发了转基因抗虫水稻华恢1号和转Cry1Ab/Cry1Ac基因抗虫水稻Bt汕优63在湖北省生产应用的安全证书^[2]。

由于水稻的主要害虫为鳞翅目昆虫，而Cry1A(b)基因对于鳞翅目昆虫具有很强的抗性，因此，Cry1A(b)基因是目前研究最多的一种Bt基因类型。Cry1A(b)基因可以抗8种鳞翅目害虫，其中包括4种螟蛾科害虫、2种夜蛾科害虫、1种眼蝶科害虫和1种弄蝶科害虫^[3]。该基因能有效提高了杀虫蛋白在转基因烟草和番茄等植株中的Bt表达量；修饰后的基因在转基因植株中的表达量比原始基因的表达量高10倍，全人工合成的基因在转化植株中的表达量比原始基因的表达量高100倍，我国目前将转Cry1Ab/c基因主要运用于抗虫水稻的研究^[4,5]。

本研究以水稻品系为试验材料，采用定性及定量PCR方法检测待测水稻样品中是否含有Cry1Ab/c外源转基因成分，判断该水稻是否为转基因产品。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有Cry1Ab/c基因），待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA 的提取与纯化

操作步骤：

1. 将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。
2. 65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。
3. 加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。
4. 将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。
5. 将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。
6. 加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。
7. 将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完 溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 重复步骤8。
10. 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
11. 将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2 引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物和探针，引物及探针序列详见下表。

2.4.3 PCR 检测

1、定性PCR扩增

聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下：

按照上述反应体系设两个对照实验。以含有目标基因的质粒作阳性对照，以水作空白对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物合成时的退火温度及扩增片段的大小设定扩增反应条件见表4。

PCR反应结束后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析使用的为1%的琼脂糖胶，将1%的琼脂糖在电泳液中充分溶解后制胶，待胶凝固后取5ul待检测的PCR产物置于点样孔中，以Super Maker做分子量标记，在180V电压下恒压电泳30分钟，电泳结束后将琼脂糖胶置于EB染液中进行染色3分钟，然后用清水缓慢冲洗凝胶5分钟，以便洗去表面的EB染料，将清洗后的凝胶置于凝胶成像系统观察。

1. 定量PCR 扩增

荧光定量PCR是一种自动化程度较高的全闭管检测，这种方法一定程度上避免了交叉污染。近年来，已经开发出的荧光染料有SYBR Green I、TaqMan等几种，被广泛地应用于检测研究，其中TaqMan探针法在转基因检测中应用最广泛^[6,7]。TaqMan技术是在普通PCR扩增系统中，加入一个与目的基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号积累实时监测PCR整个进程，最后通过制定标准曲线，根据标准曲线未知模板进行定量分析^[8-10]。本试验对待测水稻的荧光定量PCR检测是通过定量的检测方法进行定性判断。

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