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摘 要

随着转基因技术的飞速发展，转基因产品市场不断拓展，越来越多的转基因农产品商品化。转基因生物（GMO）抗逆性强、产量高、生产成本相对较低，具有较好的市场竞争性和应用前景。同时，转基因植物安全性在世界范围内引起了广泛关注，对转基因植物检测技术的需求也越来越紧迫。本实验以PCR技术为平台，通过特异性扩增转基因部件NOS终止子来对待测样品进行定性及定量检测。

关键词：转基因；定性检测；定量检测；NOS终止子

Abstract: With the rapid development of transgenic technology, transgenic products market continues to expand, more and more genetically modified agricultural products commercialization. Genetically modified organisms (GMO) with strong stress resistance, high yield, the production cost is relatively low, has good market competition and the application prospect. At the same time, the safety of transgenic plants has aroused widespread concern in the world, the transgenic plant detection technology is more and more urgent demand. In this experiment, the PCR technology as the platform, through the specific amplification of transgenic component NOS terminator to treat samples for qualitative and quantitative detection.

Key word: Transgene; The qualitative detection; Quantitative detection; NOS Terminator

目录

1 前言 5

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 6

2.4 方法 6

2.4.1 DNA的提取与纯化 6

2.4.2 引物序列 6

2.4.3 PCR检测 7

3 结果分析 9

3.1 NOS定性PCR检测体系建立 9

3.2 实时荧光定量 PCR 的验证实验 9

结论 11

参考文献 12

致谢 13

1 前言

转基因作物，是指利用分子生物学技术将某些生物的基因转移到其他物种中，使遗传物质得到改造的生物，一般作物兼具高产优质、多抗等诸多优点。由于目前尚缺乏科学依据证明转基因作物及其产品的生物安全性，人们对转基因植物潜在的风险尚存疑问，转基因产品在研究、生产和销售的过程中，存在多种扩散、污染的安全隐患，是目前转基因作物能否获准商品化生产的瓶颈所在。世界各国都在努力制定相应的法律和法规，以加强对进出口转基因植物及其产品的管理^[1]。转基因生物安全问题需要进行转基因生物安全性评价，而转基因生物检测技术是安全性评价的关键之一。因此，研究转基因动植物产品检测的关键技术，探索转基因生物计量和全程溯源技术，建立转基因生物安全检测技术体系，成为目前亟待解决的关键问题^[1]。

对转基因植物产品的检测方法，目前主要有两类：（1）以导入外源基因的特定ＤＮＡ序列为检测对象的检测技术。（2）针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方法^[2]。

本实验以水稻为研究对象，采用PCR技术对待测样品的NOS终止子进行定性及定量检测分析。NOS终止子来自于根癌农杆菌，它是植物表达载体上的终止子，具有使RNA聚合酶停止合成R和释放RNA链的作用，目的基因的转录终止是依赖其进行的。NOS终止子通常用于外援基因的插入与转基因食品的筛选检测等。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA (含有NOS终止子），待测样品为水稻颗粒由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。PCR Buffer由Thermo公司提供。PCR Buffer由Thermo公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

PCR扩增仪、电泳槽、实时荧光PCR扩增仪和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

操作步骤

1. 将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF14μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。
2. 65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。
3. 加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。
4. 将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14,000rpm离心2分钟，收集滤液。
5. 将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。
6. 加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。
7. 将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完 溶液，可多次转入，10,000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 重复步骤8。
10. 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
11. 将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA^[3]。

2.4.2 引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物，

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