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摘 要

由于我国是人口大国，确保粮食安全就变得十分重要。转基因技术已经成为各国争相开发的战略资源，因此转基因技术成为现代生物技术的核心。本实验以水稻为例，使用定性及定量PCR技术对样品进行定性及定量检测分析，可以有效的检测出水稻中是否外源基因。

关键词 水稻 转基因 定性检测 定量检测

Abstract: Because our country populous, ensure food security becomes very important. Transgenic technology has become more strategic resource of the development of the race, so it is the core of modern biotechnology to gm technology. This experiment from rice, for example, used fluorescence PCR technique to qualitative and quantitative detection of samples, to effectively detect the exogenous genes in rice. Used of fluorescent PCR technology, can quickly and accurately to establish rice transgenic detection system.

Keywords: Rice; Transgenic; Qualitative PCR; Quantitative PCR

目录

1 前言 4

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 试剂与耗材 5

2.3 仪器设备 5

2.4 方法 5

2.4.1 DNA 的提取与纯化 5

2.4.2 引物序列 6

2.4.3 PCR检测 6

3 结果分析 7

3.1 定性PCR 7

3.2 实时荧光定量PCR 8

结 论 10

参考文献 11

致 谢 12

1 前言

转基因是指利用分子生物学手段将某些生物的基因转移到其他生物物种上，使其出现原物种不具有的性状或产物^[1]。英国的普庇泰教授最早提出转基因食品安全问题。1998年他在研究中发现，幼鼠使用转基因土豆后，会使得内脏和免疫系统受损，这引起了科学界的极大关注^[2]。

实际上，在自然选择过程中，基因重组现象一直在持续，人类今天种植的普通谷物也是自然选择的结果。我们在使用这些谷物的同时，就摄入了这种谷物的野生近缘物种的抗病基因，这往往被大家忽视^[3]。在传统的杂交育种过程中，会有成千上万的新基因被引进，这些基因中的大多数是人类目前为止还没有了解到的，也没有意识到这些基因的引进为带来怎样的后果。而转基因技术是在已经普遍种植的作物中，通过加入一两种已知的新基因，来改变原有的基因状态，但是，转基因产品基因组的改变对人类和环境依然存在不确定因素和潜在风险，许多国家都制订了严格地转基因生物管理法规^[4]。

Bar基因来源于吸水链霉菌，该基因编码草丁膦乙酰转移酶（PAT），这种基因对除草剂具有拮抗作用，如果将该基因转移到水稻种，转入该基因的转基因水稻通过该基因的表达具有耐除草剂的特性^[5,6]。水稻是世界范围内的一种主要的粮食作物，但是在水稻种植过程中，很容易有杂草生长而影响水稻的长势，目前，控制杂草的方法主要有轮作和灌溉相结合的办法，近年来，通过使用除草剂去除杂草是美国的一种新型除草方法。美国公司研发的水稻品系LLRICE06和LLRICE62，通过使用基因工程技术使外源基因bar在水稻中表达，从而获得耐受草铵磷（草丁膦类除草剂的活性成分）的转基因水稻^[7]，目前该水稻品系已在6个国家获得了种植、食用、饲用等不同方面的批准。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA（含有BAR基因），待测样品水稻颗粒均由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR用2xGoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA 的提取与纯化

操作步骤如下：

（1）将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，

涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。

（2）65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次

（3）加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。

（4）将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。

（5）将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。

（6）加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。

（7）将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

（8）向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（9）重复步骤8。

（10）12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

（11）将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2 引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物和探针，序列详见下表。

2.4.3 PCR检测

1、定性PCR扩增

本研究根据实验室的一贯习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下：

按照上述反应体系设两个对照反应。并含有目标基因的质粒作阳性对照，以水作空白对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物设计时的退火温度和引物扩增片段的大小设定扩增反应条件详见下表。

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