摘 要

磁蛋白MagR通过所结合的金属离子以及规则排列，感应外界磁场变化，被称为生物指南针，这一蛋白的发现对于揭示生物迁徙中所使用的的导航系统有很大的意义。而INP细菌表面展示系统凭借着其自身分泌，锚定于细胞膜，且能稳定表达外源蛋白而被广泛的应用于各种大分子细菌表面展示的系统中。本文将磁蛋白MagR的N端与INP的C端连接构成细菌表面展示载体，并利用IPTG诱导含有MagR-INP片段的重组质粒表达，检测该磁感应蛋白的表达情况。同时用表达了该蛋白的细菌菌体进行生物矿化研究，检测磁蛋白是否能诱导一些离子进行吸附或者能诱导一些材料的晶体的晶形是否改变，从而对该蛋白的生物学特性进行研究。结论是INP-MagR重组表达载体构建成功，且INP-MagR重组蛋白可在大肠杆菌细菌表面稳定表达，并且该蛋白的表达对于细菌的生长有促进作用；同时对表达了该蛋白的大肠杆菌进行的矿化研究，通过SEM、EDS进行表征，发现该蛋白无法吸附铝离子，以及诱导SiO₂的聚集，而对于碳酸钙晶体形成的影响，由于实验条件的不准确，导致实验结果不甚理想，所以对于该蛋白性能的研究还需要进一步的探索。

关键字：磁蛋白MagR,INP细菌表面展示蛋白，质粒构建，蛋白表达，生物矿化

Abstract

The magnetoprotein MagR is called a biometric compass by the combination of the metal ions and the regular arrangement, which induces changes in the external magnetic field. The discovery of this protein is of great significance in revealing the navigation system used in biological migration. . The INP bacterial surface display system is widely used in the surface display systems of various macromolecular bacteria by virtue of its own secretion, anchorage to the cell membrane, and stable expression of foreign proteins. In this study, the N-terminus of MagR protein was ligated to the C-terminus of INP to form a bacterial surface display vector, and IPTG was used to induce the expression of the recombinant plasmid containing the MagR-INP fragment, and the expression of the magnetic protein was detected. At the same time, biomineralization was studied using bacterial cells expressing the protein and whether the magnetic protein could induce some ions to adsorb or induce the crystal shape of some materials to change, so as to study the biological characteristics of the protein. The conclusion is that INP-MagR recombinant expression vector is successfully constructed, and the INP-MagR recombinant protein can be stably expressed on the surface of E. coli bacteria, and the expression of this protein can promote the growth of bacteria; meanwhile, it is performed on the E. coli expressing the protein. Mineralization studies, characterized by SEM and EDS, found that the protein could not adsorb aluminum ions and induce aggregation of SiO2, but the effect on the formation of calcium carbonate crystals was not satisfactory due to inaccurate experimental conditions, resulting in less than ideal experimental results. The study of the protein properties needs further exploration.

Key words: magnetoprotein MagR；INP bacterial surface display protein；plasmid construction；protein expression；biomineralization

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第1章 绪论 1

1.1磁感应蛋白 1

1.2细菌表面展示体系 2

1.3生物矿化 3

1.3.1生物矿化与纳米材料 3

1.3.2生物矿化与纳米药物载体 4

1.3.3生物矿化与肿瘤治疗 4

1.4研究目的，内容，意义 5

第2章 材料与方法 6

2.1 试剂和仪器 6

2.2 实验方法 8

2.2.1 培养基 8

2.2.2菌种活化和保存 8

2.2.3质粒提取 8

2.2.4 PCR克隆 8

2.2.5氯化钙法制备感受态细胞 10

2.2.6 酶切 10

2.2.7 PCR产物消化纯化 11

2.2.8连接 11

2.2.9热激法转化质粒 11

2.2.10 菌落PCR筛选 12

2.2.11 蛋白诱导表达 12

2.2.12 初步矿化方法 13

第3章INP-MagR 表达载体构建 14

3.1 引言 14

3.2引物序列设计 14

3.3 BamHI、NcoI酶切位点引入 15

3.4 INP基因片段的扩增 16

3.5 双酶切 17

3.7热激法转化质粒，转化单菌落筛选 17

3.8 本章小结 19

第4章 INP-MagR 重组蛋白诱导表达 20

4.1 引言 20

4.2 IPTG浓度梯度诱导表达 20

4.3 时间梯度诱导表达 22

4.4 本章小结 23

第5章 磁蛋白初步矿化研究 24

5.1 引言 24

5.2 矿化后的结构表征 24

5.3矿化细菌的表征结果 24

5.6 本章小结 26

第6章 总结与展望 28

6.1 总结 28

6.2 展望 28

参考文献 30

致 谢 32

第1章 绪论

1.1磁感应蛋白

在自然界中有很多物种都可以长距离的迁徙，以及按照磁场方向活动，这些都与他们能准确感受地球磁场的变化，并以此作为自己的导航指南有很大关系^[1]。但生物为什么能自己导航以及他们所凭借的生物学基础是什么^[2]？所有的这些都引起了科学家的兴趣，对于寻找和理解产生这样化学机理背后的生物学机制的探索一直在进行中。

目前，学术界对此存在两种不同的假说：一种是基于磁铁矿的磁感受假说---超顺磁颗粒在外部磁场的作用下，磁化强度会迅速沿着外部磁场方向排列，从而被吸引或者排斥，使超顺磁颗粒簇排列发生变化,而这种变化会影响到该细胞膜上的离子通道开放，从而改变膜电位，神经系统检测到这种膜电位变化，从而对此种磁场做出应答，形成对磁场的反应^[3]；另一种是在欧洲知更鸟的“光影响导航”的现象下提出的，光受体蛋白-隐花色素在接受光激发时会产生的一对自由基，其电子状态被地磁场改变，致使隐花色素生化活性发生改变并进一步影响神经元的活化程度，从而使一些动物可以感应到地磁场的变化^[4-5]。

而在2015年，谢灿课题组发现了一种新的磁受体蛋白，对于生物磁感现象的生物基础的揭示又进了一步。课题组首先根据以往关于生物磁感应受体的研究，预测和假定该蛋白所具有的的性质：首先Cryptochromes（Cry）是一类与光解酶密切相关的黄素蛋白，已被许多科学家发现，仍然是最好的生物化学磁性受体候选者，然而它本身无法形成磁性指南针的基础^[6]；其次需要具有亚铁磁性的矿物（例如磁铁矿）作为生物磁性罗盘来接收和响应地磁线索。因此他们通过计算机建模和实验验证，在大肠杆菌体内发现一种蛋白可与Cry形成复合物，随后又通过计算机模拟和体外实验得到该蛋白的结构特征：该蛋白通过线性多聚化组装形成了一个棒状核心聚合物，MagR位于核心，每个MagR分子中均有铁硫簇形成的“铁环”(iron loop)位于中心，用于磁场感应，简称铁硫蛋白^[7]。作者通过电镜观察到MagR蛋白质复合物在溶液中具有特征性的排列取向，表明该蛋白复合物能感应到微弱的地球磁场（在北京大约为0.4 Gs），并沿着地球磁场排列^[7]。实验中也通过外加磁场，以及商业磁力计观测到了蛋白质晶体磁场的依赖性，能明显被铁磁物质磁化，从而推测该蛋白为磁感应蛋白^[8]。

之后张生家课题组发现，在同源细菌铁硫簇蛋白的协助下， MagR的表达水平可以被外磁场刺激活化，而MagR的表达可引起膜的去极化以及动作电位的变化，影响神经活动与行为定位，故而张生家教授认为单独的MagR蛋白可以响应磁场强度，并且可以应用于控制神经元的活性，这一结论引发了科学界对磁受体蛋白对磁场响应的广泛研究^[9]。

但谢灿课题组又将该蛋白在不同神经细胞内表达，且用磁场对该细胞进行磁刺激，检测神经细胞内钙离子内流的程度。他们在相同的持续时间内通过相同的自制装置对HEK293细胞系施加磁刺激，并没有观察到有或没有MS的细胞内钙的任何变化;且HEK293细胞中的钙信号持续升高，且MS终止后也不会下降^[10]。细胞内钙的持续升高可能是反应细胞不健康状态的指示，是由于不健康的细胞状态（培养差，DNA转染不当，温度波动等），而不是MS所引起的钙离子内流。在他们的每个实验中，他们应用了ATP，一种已知可诱导HEK293细胞中钙升高的药物，且观察到ATP应用后细胞内钙的强烈增加，随后迅速下降，表明这些细胞保持健康^[10]。所以他们认为单独的MagR不具有內禀磁性，不足以介导神经细胞对磁场刺激做出反应^[10]。

MagR自身的结构特点和生物学特点也推开了磁生物学应用的大门，为未来发展基利用磁场进行大分子分离纯化，以及调控细胞活性和动物行动提供了无限可能;另外对磁遗传学,以及新型磁性生物材料的开发开辟了广阔的前景，吸引着众多的科学家来探寻关于该蛋白的其他用途。所以本文，我们将MagR基因和INP基因共表达与细胞表面^[11]，并利用实验室已有的矿化体系，来探究该蛋白是否能够矿化一些有机或者无机材料，从而得出关于该蛋白性能方面的特性。

1.2细菌表面展示体系

运用DNA重组技术，将目的蛋白或多肽的基因序列与细胞膜锚定基序连接起来，通过诱导表达，将其所需要的目的蛋白或多肽表达于细胞膜上，能够很好地避免宿主细胞胞内酶对外源蛋白的降解影响，克服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠，纯化困难等弊端^[12]。INP蛋白可通过其N端特定的基团锚定于细胞表面，因此可在C端，或中间部分将外源蛋白连接，共同分泌到细胞膜上，因此在荧光标记，化学物质检测等方面应用广泛^[13-14]。

近期浙江省医学科学院药物所利用INP细菌表面锚定蛋白将存活蛋白表达于细菌表面，在广谱抗肿瘤疫苗的制备方面取得了很大成就。肿瘤细胞表面有一种特殊蛋白-存活蛋白,是一种广谱肿瘤相关抗原，可激发机体产生抗肿瘤反应，还可引起细胞毒T细胞(CTL)反应等免疫反应, 常被用来作为肿瘤治疗的特异性抗原模型，故而将该蛋白表达于细菌表面，易于纯化和操作，对于肿瘤的潜在诊断与治疗具有很大意义^[15]。

细菌表面展示疫苗也是近年来细菌表面展示技术研究的热点^[16]。2016年，有人用INP蛋白作为细菌表面展示蛋白将副结核分支杆菌的抗原表达于大肠杆菌表面，并经分离纯化感染小鼠后，观察到小鼠体内引起了强烈的细胞免疫反应，说明其能抵抗副结核分枝杆菌的感染,有利于研制新型副结核分枝杆菌疫苗^[17]。另外INP细菌表面展示技术，也可以用来快速的鉴定细菌菌株种型。比如最近发现的一种葡萄糖脱氢酶突变菌株的筛选方法中，实验者通过细菌表面展示的葡萄糖脱氢酶突变基因库，再结合蓝白斑筛选，可以快速的筛选出突变菌株^[18]。

1.3生物矿化

生物矿化过程在自然界中是一个极为普遍的现象，是指在生物体细胞或者蛋白等大分子的作用下，从环境中选择性的沉积一些无机元素在有机介质中，将其转化为固相矿物从而形成矿化物的过程^[19]。 在自然界中许多生物都可以通过生物矿化形成一些功能性材料，迄今为止已有60多种生物矿化材料在生物体内发现，主要包括碳酸钙，草酸钙，二氧化硅，二氧化钛，氧化铝，氧化铁体系等等；除了这些功能性材料，生物体内还会构成对自身有害的矿物，如泌尿结石，胆结石和胃结石等。但这些矿化物的形成离不开生物体这个有机体介质^[19-21]。

生物诱导矿化是生物天然演化过程中所产生的选择性策略，自然界中的一些生物可以利用生物矿化形成的物质获得额外的保护^[22]。牙齿，骨骼，贝壳，鳞片等可使生物向更高层次进化^[22]。同时生物诱导矿化更是生物界中材料制备的策略，例如海胆矿化形成的骨针由方解石单晶组成，但又比方解石单晶型那样易裂，具有独特的力学性能；贝壳珍珠层是由95以上的碳酸钙组成，比单相碳酸钙的断裂韧性高3000倍以上^[23]；同样由细菌硅蛋白所诱导形成的二氧化钛材料更加细小和均匀可用于锂离子电极材料中。近年来生物矿化越来越被运用到其他方面，比如细胞保存，细胞治疗，细胞跟踪，细胞分离,环境保护等，更为先进的是肿瘤治疗也与生物矿化有着莫大的关系，通过生物矿化，也许肿瘤不再是影响人类健康的一种因素^[24-25]。

1.3.1生物矿化与纳米材料

纳米材料从发现到现在，合成技术已经较为成熟和系统，可以得到特定形貌，特定尺寸，特定组成的单分散纳米晶体，但由于是化学或者是物理合成方法，需要耗费较大的成本，所以应用起来较为麻烦。仿生矿化解决了化学合成或者物理合成方法中所出现的缺陷，它利用生物界矿化的原理和过程，将特定的有机或无机矿物在这些具有特定性质的有机质的介导下，在常温差压下形成比无机合成可能更为细小，性能更加优良的材料，吸引力许多科学家去研究^[26]。

多种纤维蛋白凭借着其丰富易得，多种氨基酸残基和官能团，分子结构精密，特殊的结构和规则的尺寸，且易被制成胶体溶液等特性被广泛应用于纳米材料的制备^[27]。比如纳米银颗粒可在蚕丝蛋白中的酪氨酸的还原力作用下，形成蚕丝蛋白-纳米银复合物，该复合物具有破坏生物膜的功效^[27]；大肠杆菌表面表达的硅蛋白Silaffin和Silicatein，可诱导二氧化钛在细菌表面聚集，且经过煅烧后形成了中空介孔的二氧化钛颗粒，可被应用于锂离子电极材料中。

1.3.2生物矿化与纳米药物载体

每年具有大量的新型药物被投放到市场，满足着各种疾病的需要。但一些药物由于其独特的生物学特性，比如半衰期短，快速释放等特点，而无法达到理想的治疗效果，所以寻求一种新的药物载体已经成为各大医药公司的热门研究内容。纳米药物载体由于其分子尺寸的优点被广泛关注负，但是也随之带来一些问题，比如化学合成导致的生物相容性差，体内免疫反应强烈等缺点都需要解决。

为了合成更为优良的材料，生物矿化所形成的的纳米材料进入人们的视野。生物矿化形成的纳米药物载体不但具有优良的生物相容性和稳定性，解决了化学合成所带来的机体排斥以及免疫反应的问题；并且可以通过控制有机质的加入来调控载体形成，可达到形成不同特性纳米药物载体的目的。目前研究较为透彻的是磷酸钙，碳酸钙，氧化铁等纳米载体，我们可以在这些在体形成过程中，加入一些物质，或者改变实验条件，从而使载体带上特性，比如可控释放，外部刺激响应释放^[28]，以及靶向性等。比如《生物材料》中收录的Yang将阿霉素和超顺磁性四氧化三铁纳米粒子包覆到共聚物材料中形成多功能纳米药物载体。该载体具有高效的pH 值敏感性，定位控制释放肿瘤药物，SPIO 显像明显等优点，不仅可以诊断肿瘤同时又为治疗提供了方便^[29]。

1.3.3生物矿化与肿瘤治疗

生物矿化所形成的材料不仅可以用于工业用途，还可以用于疾病的治疗，如修复牙齿，预防病理性疾病，以及肝脏组织工程，肿瘤治疗等。传统意义上的肿瘤治疗需要靠一些药物和化学射线来进行化疗和放疗，以期达到杀死癌细胞的目的，但由于针对性不强，在杀死病变细胞的同时，也对正常细胞造成了伤害，所以现在浙江大学的一些学者提出了一种新的肿瘤治疗方法。

他们提出将仿生病理矿化引入肿瘤治疗中，通过在某些叶酸受体过度表达的癌细胞表面诱导钙离子的矿化，使肿瘤细胞核变得异常从而杀死癌细胞。这种利用体内细胞本身具有的物质使肿瘤细胞死亡的方法，不仅对自身细胞无任何伤害，已经超越普通化疗的效果；而且还通过矿化外层有效抑制肿瘤的增殖和转移，从而大幅度提高了疾病的存活率。在本实验中所使用的叶酸和钙离子在人体中广泛存在，因此该方法提出了一种全新的无需药物的肿瘤治疗方法^[30]。

1.4研究目的，内容，意义

本论文研究目的：利用表达了磁蛋白的菌体对几种离子或者晶体的矿化研究，探索该磁感应蛋白能否与外界环境发生联系，从而推测其可能具有的性能。

本论文研究内容：磁蛋白通过所结合的金属离子以及规则排列，感应外界磁场变化。目前对于磁蛋白结构和功能只是初步研究，所以本论文利用蛋白质工程技术，将磁蛋白展示于细菌表面，从而探究磁蛋白的性能和相关用途。（1）首先选择合适细菌表面锚定蛋白INP，通过对磁蛋白序列以及INP序列的研究，选择合适的连接位点;（2）通过分子生物学技术构建磁蛋白的细菌表面展示载体，将本课题组前辈使用的INP片段，通过PCR扩增出来，并连接到pET-28a MagR质粒载体上，再转化到大肠杆菌BL21菌株内；（3）其次，利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）能解除阻遏，诱导外源蛋白表达的原理，诱导重组蛋白（INP-MagR）表达，并通过SDA-PAGE电泳检测蛋白表达情况；（4）最后，对表面展示磁蛋白细菌的性能，探索表达了重组蛋白的细菌能否影响CaCO₃晶体，以及是否可诱导AL³ , SiO₂的吸附，从而探索该磁感应蛋白的性能。

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