摘 要 莲具有很高的药用价值，其生物碱成分具有多种药理活性。WRKY转录因子可以调控生物碱合成，并与激素介导的信号通路密切相关，同时激素也可以调控生物碱合成。目前，WRKY转录因子在陆生植物中的研究较多，其在莲中的研究是一个较新的领域。 本课题利用生物信息学方法对莲WRKY转录因子序列进行鉴定、进化分析和保守域分析，最终得到56个莲WRKY转录因子序列，可分为三类，分别含有11、39和6个成员。依据拟南芥WRKY基因的功能，筛选得到9个可能参与激素信号通路的莲WRKY基因，并利用实时定量PCR技术检测水杨酸（SA）处理下这些基因的表达情况。结果表明这些基因在SA处理后相对表达水平的变化趋势基本一致，均为先上升后下降，表明莲WRKY基因能被SA所诱导，可能参与激素介导的生物碱合成过程的调控。这些结果为研究WRKY转录因子调控莲次生代谢物合成过程的相关机制奠定基础。 关键词：莲；WRKY转录因子；植物激素；进化分析；实时定量PCR Abstract Lotus is of high medicinal value. Alkaloids, a group of natural secondary metabolites, provide a variety of pharmacological activities. WRKY transcription factors can regulate the synthesis of alkaloids. These processes are closely related to hormone-mediated signaling pathways. Hormones also regulate the synthesis of alkaloids. At present, the research regarding to WRKY transcription factors is mainly focused on terrestrial plants, aquatic plants like lotus is not studied yet. In this study, the identification, phylogenetic and conserved domain analysis of the lotus WRKY transcription factors were performed by bioinformatics. We obtained 56 WRKY transcription factor sequences and they could be divided into three groups, which contained 11, 39 and 6 members respectively. Based on the functions of WRKY gene in Arabidopsis thaliana, nine WRKY genes in lotus that may participate in hormone signaling pathway were screened, and the expression levels of these genes under salicylic acid (SA) treatment were detected. The results showed that the trends of relative expression levels of these genes were almost consistent. They were all rapidly induced, with maximal expression 6 h after SA application. These results showed that the WRKY genes in lotus could respond to SA, indicating their involvement in hormone mediated-synthesis of alkaloids. Taken together, these results would provide a basis for searching for the function of WRKYs in regulating secondary metabolites synthesis in lotus. Key words: Lotus; WRKY transcription factor; plant hormone; phylogenetic analysis; real-time quantitative PCR 目录 第1章 绪论 1 1.1 WRKY转录因子概述 1 1.2 WRKY转录因子的结构特点 1 1.3 WRKY转录因子的功能 2 1.3.1 WRKY转录因子对植物生长发育的调控 2 1.3.2 WRKY转录因子调控植物抗环境胁迫 2 1.4 WRKY转录因子参与激素信号转导途径 3 1.5 莲生物碱与莲WRKY转录因子研究进展 4 1.5.1 莲及莲生物碱概述 4 1.5.2 激素响应的WRKY转录因子对生物碱合成的调控 4 1.6 研究内容及技术路线 5 第2章 材料与方法 7 2.1 实验材料 7 2.1.1 植物材料 7 2.1.2 实验主要试剂 7 2.1.3 实验主要仪器 8 2.2 实验方法 8 2.2.1 莲WRKY转录因子的筛选及生物信息学分析 8 2.2.2 莲WRKY蛋白序列聚类分析 9 2.2.3 莲WRKY蛋白的保守域分析 9 2.2.4 莲幼苗处理及采样 9 2.2.5 莲总RNA的提取及质量分析 9 2.2.6 cDNA合成 10 2.2.7 实时荧光定量PCR 10 2.2.8 统计分析 11 第3章 结果与分析 12 3.1 莲WRKY转录因子的筛选及生物信息学分析 12 3.2 莲WRKY蛋白序列聚类分析 14 3.3 莲WRKY蛋白的保守域分析 15 3.4 莲中WRKY基因受SA诱导表达分析 18 3.4.1 RNA提取质量分析 18 3.4.2 荧光定量PCR分析 19 第4章 讨论 21 4.1 莲WRKY转录因子的生物信息学分析 21 4.2 SA响应的莲WRKY基因的表达谱分析 22 第5章 结论与展望 23 参考文献 25 致谢 28

绪论

WRKY转录因子概述

转录因子在调控基因表达过程中扮演着十分重要的角色，它们可以与靶基因启动子区的特定DNA元件相结合，控制下游相关基因的表达^[1]。WRKY转录因子是高等植物中研究比较多的一类转录因子，1994年在甘薯中发现第一个WRKY转录因子——SPF1（Sweet Potato Factor 1），自此开辟了关于植物中WRKY转录因子的研究领域^[2]。WRKY转录因子具有保守的WRKYGQK核心序列以及特定的锌指结构，对W-box有结合偏好，调节下游基因的表达。很多研究表明，WRKY转录因子不仅参与植物生长发育、物质代谢等重要生理活动，还调控植物对生物胁迫（包括病原微生物和植食性昆虫等）及非生物胁迫（包括干旱、高温、土壤盐渍化、冷害等）的应答反应，同时在激素信号传导途径中发挥功能^[3-4]。

WRKY转录因子的结构特点

WRKY转录因子因具有保守的WRKY结构域而命名，结构特点为具有高度保守的七肽WRKYGQK（少数还有WRKYGKK、WKKYGQK、WRKYGQR、WRKYGEK等形式），其序列改变往往造成WRKY结构域的DNA结合活性减弱或丧失。另外还包括两种不同类型的锌指结构，分别为C₂H₂型和C₂HC型。根据该结构特点，WRKY转录因子可分为三大类。第I类在序列的N端和C端各有一个WRKY结构域，而其他两类只在C端含有一个WRKY结构域。第I类和第II类具有C₂H₂型锌指结构，而第III类具有C₂HC型锌指结构^[4-5]。第I类WRKY转录因子位于N端的WRKY结构域没有DNA结合活性，推测它对C端WRKY域与靶序列的结合起辅助作用，使WRKY转录因子与DNA结合更高效^[3,6]。 WRKY转录因子通常可以与下游靶基因启动子中的W-box（TTGACC/T）特异性结合来调控其表达。W-box保守序列的核心为TGAC，在其周围的侧翼序列会影响转录因子与W-box结合的亲和力与特异性。植物衰老、损伤及防御反应相关基因的启动子中出现W-box的频率较高，通过与WRKY转录因子结合发挥不同的生物学功能。W-box也存在于自身目标基因或其他WRKY基因中，从而实现自调控以及对其他WRKY基因的交叉调控。除与W-box结合外，WRKY转录因子还可结合其他顺式作用元件（如Wt-box、糖响应顺式作用元件）或与其他蛋白质构成复合体行使功能^[7-8]。

WRKY转录因子的功能

WRKY转录因子对植物生长发育的调控

在植物生长发育的各个阶段，WRKY转录因子参与许多生理过程^[4]。Zhang等人研究发现OsWRKY78基因在水稻的伸长茎和种子中高表达，OsWRKY78基因 RNAi株系及wrky78单基因突变体表现出半矮化表型，种子长度较短，而其过表达植株与野生型表型一致。表明OsWRKY78转录因子参与调控茎的生长和种子发育^[9]。拟南芥WRKY75转录因子可以与开花控制基因FLOWERING LOCUS T（FT）的启动子结合正向调控植物开花。WRKY75基因突变使FT基因的转录水平降低导致开花延迟，而该基因过表达会明显促进拟南芥开花^[10]。另外，有研究表明WRKY转录因子可以调控植物衰老过程^[11]。拟南芥wrky54wrky70双基因突变体表现出早衰表型，SAG12和SEN1等衰老相关基因的表达发生改变。这些结果表明，WRKY54和WRKY70转录因子能够延缓拟南芥衰老^[12]。相反的是，BrWRKY65转录因子在菜心（Brassica rapa var. parachinensis）的衰老过程中具有正调控作用，通过直接与BrNYC1、BrSGR1和 BrDIN1三个衰老相关基因的启动子区的W-box结合并激活它们的表达，促进菜花叶的衰老^[13]。

WRKY转录因子调控植物抗环境胁迫

植物生长过程中常常受到细菌、真菌、病毒等病原微生物的侵害，在长期进化过程中，植物发展出两种主要的防御机制抵抗各种病原微生物的入侵，分别为病原体相关分子模式触发的免疫反应（PAMP-triggered immunity, PTI）以及效应因子二次免疫反应（Effector-triggered immunity, ETI）。在PTI和ETI这两种防御机制中都需要WRKY转录因子的参与^[14]。拟南芥wrky54wrky70双基因突变体能够提高水杨酸（SA）水平和活性氧（ROS）的积累，增强对腐生型病原菌的抗性。结果表明WRKY54和WRKY70转录因子在腐生型病原菌对植物的胁迫反应中具有负调控作用^[15]。水稻中OsWRKY24基因在接种稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）时表达上调，嵌合阻遏物（OsWRKY24-SRDX）抑制了OsWRKY24转录因子的功能使水稻表现出对稻瘟病菌的易感性，表明OsWRKY24转录因子对水稻抗稻瘟病起正调控作用^[16]。VlWRKY48基因过表达的转基因拟南芥对白粉菌表现出较高的抗性，AtICS1、AtNPR1、AtPDF1.2等抗病防御基因的表达量上调^[17]。除了病原菌的侵染外，植食性昆虫对植物的攻击而产生的抗性反应也涉及WRKY转录因子的调控。桃蚜（Myzus persicae）侵染可诱导拟南芥WRKY22基因的表达，通过T-DNA插入及过表达株系的构建证实了AtWRKY22转录因子通过调控SA和茉莉酸（JA）介导的信号转导途径增加了拟南芥对桃蚜的易感性^[18]。 除受到生物胁迫外，干旱、土壤盐渍化、极端温度等非生物胁迫常常造成植物形态结构、生理活动和基因表达发生变化，甚至导致植物减产或死亡。研究表明，WRKY转录因子参与调控植物的非生物胁迫反应^[4]。小麦TaWRKY146基因在拟南芥中的过表达可诱导气孔关闭，减少水分损失，增强植物的抗旱性^[19]。苜蓿MsWRKY11基因的过量表达提高了盐胁迫下转基因大豆的发芽率，并促进幼苗的下胚轴生长，通过降低ROS水平来增加大豆的耐盐性^[20]。拟南芥WRKY54和WRKY70转录因子不仅调控植物衰老以及响应生物胁迫，在渗透胁迫反应中也具有重要作用。在胁迫条件下，wrky54wrky70双基因突变体可以增强气孔关闭，提高植物对渗透胁迫的耐受性^[21]。拟南芥AtWRKY25转录因子通过调控HsfA2、HsfB1、HsfB2a等热诱导基因的表达提高对高温胁迫的抗性^[22]。黄瓜CsWRKY46转录因子正调控冷应答基因的表达，增强植物的耐寒性^[23]。

WRKY转录因子参与激素信号转导途径

在WRKY转录因子调控植物应对环境胁迫的过程中，常常与SA、JA、脱落酸（ABA）等激素介导的信号通路密切相关。这些植物激素可以诱导WRKY基因以及下游防御基因的表达，在植物抗逆过程中发挥重要作用^[24]。拟南芥中WRKY70转录因子位于SA和JA介导的信号通路之间的交叉调控位点，激活SA介导的信号转导途径，同时抑制JA介导的信号转导途径^[25]。SA处理可诱导葡萄VqWRKY52基因的表达，将Pro_VqWRKY52:GUS融合表达载体转入烟草中，经SA处理后表现很高的GUS活性。这些结果表明VqWRKY52转录因子在SA介导的信号转导途径中发挥重要作用^[26]。此外，香蕉MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60及MaWRKY71转录因子参与ABA介导的信号通路，与ABA合成相关基因MaNCE1和MaNCE2启动子中的W-box结合并激活它们的表达^[27]。 随着高通量测序技术的普及，人们已经掌握了很多物种的基因组序列。很多研究者通过基因芯片、微阵列分析、荧光定量PCR技术等对激素处理下的转录谱、表达谱进行分析，发现很多WRKY基因对激素信号分子响应并差异性表达^[5,28]。Zhang等人鉴定得到79个马铃薯WRKY基因，用SA处理3h和24h后分别检测其中22个候选基因的表达量变化。分析发现大多数基因的表达量与对照基本一致，有的甚至下调，只有7个基因表达上调^[5]。Ramamoorthy等人在粳稻中鉴定到103个WRKY基因，其中28个基因在SA处理后显著差异表达，还发现12个对茉莉酸甲酯（MeJA）响应的WRKY基因^[28]。Wang 等人在杨树中鉴定得到10个第III 组WRKY基因成员，用0.1M SA和ABA处理，检测到9个基因上调。其中PtrWRKY54基因和PtrWRKY30基因的表达在SA处理后显著上调，而两种激素处理下的PtrWRKY90基因在所有时间点表达量均下调^[29]。

莲生物碱与莲WRKY转录因子研究进展

莲及莲生物碱概述

莲（Nelumbo nucifera Gaerth）为莲科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo）的多年水生植物，主要分布在中国、日本、印度等亚洲国家及澳洲北部。莲在我国种质资源丰富，栽培历史悠久，且分布十分广泛。莲具有较高的药用价值，几乎各个部分均可入药。莲的药理活性主要来源之一即为其含有的生物碱成分。莲中生物碱均属于异喹啉类，主要在荷叶及莲心中累积，荷叶中提取到的生物碱主要为单苄基异喹啉类和阿朴啡类。《秘传证治要诀》中记载：“荷叶服之，令人瘦劣。”现代很多研究也证实了莲生物碱的降脂减肥功效。除此之外，研究表明莲中生物碱还具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗肿瘤等药理作用^[30-31] 。生物碱等许多次级代谢物具有很高的药理活性，但一般在植物中的含量较少。虽然我国的莲资源十分丰富，但利用度很低。仅依靠传统培育技术获得莲生物碱的产量有限，难以满足市场需求，通过深入探究莲中生物碱合成的调控机制，利用基因工程手段从分子层面对莲进行改造，为培育高产莲品种及大规模生产莲生物碱提供可能。

激素响应的WRKY转录因子对生物碱合成的调控

据报道，WRKY转录因子可以调控生物碱等次级代谢物的合成^[32-33]。拟南芥AtWRKY41及油菜BnWRKY41-1转录因子均负调控花青素的合成^[34]。黄连CjWRKY1转录因子通过调控去甲乌药碱合成酶（NCS）、乌药碱N-甲基转移酶（CNMT）、甲基乌药碱羟化酶（CYP80B2）等基因的表达来调控小檗碱的生物合成^[35]。马铃薯StWRKY8转录因子可以与酪氨酸脱羧酶（TYDC）、去甲乌药碱合成酶（NCS）和可待因酮还原酶2（COR-2）的启动子相互作用来调控苄基异喹啉生物碱（BIAs）的生物合成^[36]。长春花（Catharanthus roseus）中CrWRKY1基因的过表达使萜类吲哚生物碱（TIAs）途径的几个关键基因表达上调，尤其是色氨酸脱羧酶（TDC）。另外TIAs合成途径的酶基因的启动子基本都含有W-box，其中TDC基因的启动子中含有4个W-box，说明CrWRKY1转录因子参与调控TIAs的合成^[33]。同时，WRKY转录因子参与各种生物碱合成调控都与激素介导的信号通路密切相关，并且激素也影响生物碱的合成。在长春花中，MeJA可以诱导几乎所有TIAs合成相关的酶基因表达，同时可以诱导参与生物碱合成的多种转录因子表达。长春花中大概有1/3CrWRKY转录因子可以被MeJA诱导。ORCA3转录因子属于AP2/ERF类转录因子，在其启动子区域存在茉莉酸响应元件（JERE），经JA诱导可以增强TIAs合成途径相关基因表达，并促进TIAs前体物质合成。CrMYC2转录因子是从长春花中发现的一个bHLH类转录因子，可以通过激活ORCA3转录因子来调控响应MeJA的TIAs的合成^[32,37]。除了MeJA可以影响生物碱合成外，乙烯利也可以促进长春花中蛇根碱、长春质碱及长春碱的积累，而6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和赤霉素（GA3）可以促进金钗石斛总生物碱含量^[38-39]。由此可见，激素对生物碱的合成尤为重要。目前，很多研究只是发现WRKY转录因子与生物碱合成相关，但具体的调控机制仍不清晰。尤其是像莲这种水生植物，WRKY转录因子的研究仍为空白，其对莲生物碱合成的调控作用更是无从得知。所以，我们利用生物信息学方法对莲WRKY转录因子进行鉴定和分析。依据拟南芥等模式植物的WRKY转录因子广泛受到SA等激素信号的诱导，我们推测莲WRKY转录因子可能也对SA存在响应。如果莲WRKY基因可以被SA诱导，那么这些转录因子可能会参与调控由激素介导的莲生物碱合成。

研究内容及技术路线

以白花建莲作为研究对象，利用已知的拟南芥WRKY基因序列通过在莲基因组数据库中同源搜索，获得莲WRKY基因候选序列，并从中筛选可能和激素信号通路相关的候选WRKY基因。利用实时荧光定量PCR技术检测SA处理下的莲WRKY基因的表达情况，分析比较SA处理后的基因表达差异，找到对激素信号响应的基因,可以作为研究WRKY转录因子调控莲生物碱合成中的候选基因，为进一步提高莲生物碱产量及优化莲种质资源的研究奠定基础。本课题技术路线详见图 1.1。