摘 要 莲是我国栽培面积最大的水生经济作物，具有极其重要的食用、观赏和药用价值。莲完整的组培再生体系至今尚未构建，这严重制约了莲的遗传改良进展及莲分子水平的基因功能研究。本课题通过选用不同品种、不同来源的莲组织、器官为外植体材料，有针对性地改良消毒方法及不同培养基的激素配比，探讨和优化了莲的无菌苗培育体系和愈伤组织诱导体系。 结果表明，相对于储藏莲子的成熟胚，新鲜莲子的成熟胚内生菌少，消毒后容易生长成健康的无菌苗。幼嫩莲子的子叶最易诱导出愈伤组织，诱导率在90%以上，尤以‘白花建莲’子叶的愈伤组织诱导情况最好；无菌苗的下胚轴、叶片、叶柄均可作为外植体进行愈伤组织诱导，其中下胚轴愈伤组织诱导率（81.36%）最高，叶片（43.00%）和叶柄（28.30%）次之。自然栽培池的莲叶片、叶柄，以及储藏莲子经浸泡发芽后的胚芽，均难以经过消毒完全除菌，不适合选作外植体进行愈伤组织诱导。此外，检测结果也表明，莲愈伤组织有少量苄基异喹啉类生物碱累积，生物碱合成相关基因也有显著表达。 研究特色：构建了莲的无菌苗及愈伤组织诱导体系，并首次证明了莲愈伤组织中有少量苄基异喹啉类生物碱累积，这为今后构建完善的莲组培再生体系，应用于莲生物碱合成和调控等相关研究夯实了基础。 关键词：莲；外植体；组织培养；无菌苗；愈伤组织；生物碱 Abstract Lotus is the largest aquatic crop cultivated in China, which has significant values in food, ornament and medicine. To date, lotus tissue culture and plantlet regeneration system has not yet fully constructed. This hampered the process of lotus germplasm improvement, and the genomic functional studies. Through selection of different lotus tissues and organs as explant, and improvement of sterilization methods and plant hormone ratios for cultivation medium, we constructed and optimized an aseptic seedling cultivation system and callus induction system for lotus. Our results showed that, compared to the stored lotus seeds, the mature embryos from fresh lotus seeds have much less endophyte, and can be easily sterilized, thus are excellent explants for lotus aseptic seedlings cultivation. Cotyledons derived from young lotus seeds are superior explants for callus induction. The callus induction rate of cotyledons from all four tested lotus cultivars were over 90%, among which, cv. ‘Jian Lotus White’ is the best. Leaves, petioles and hypocotyls collected from the in vitro lotus seedlings are also excellent explants for callus induction, with the hypocotyls owed the highest callus induction rate (81.36%), followed by leaves (43.00%) and petiols (28.30%). Lotus leaves and petioles taken from natural growth pond, and germinated embryos of stored lotus seeds, however, are all difficult to be completely sterilized, thus are not suitable as explants for callus induction. In addition, our results also showed that benzylisoquinoline alkaloid (BIA) biosynthetic genes were expressed in lotus callus, and low amount of BIAs were detected in lotus callus. Characteristics of the study: A lotus aseptic seedling cultivation and callus induction system has been successfully constructed. We have detected for the first time that BIA biosynthetic genes expression and BIA deposition in lotus callus. This lays a solid foundation for the future construction of comprehensive lotus tissue culture and regeneration system, and using it in studies of lotus alkaloid biosynthesis and regulation. Key words: lotus; explants; tissue culture; aseptic seedlings; callus; alkaloid 目录 第一章 绪论 1 1.1 植物组织培养概述 1 1.2 植物组织培养主要技术要点 2 1.2.1 外植体选择 2 1.2.2 消毒方法 2 1.2.3 培养基 2 1.2.4 激素配比 3 1.2.5 外植体培养环境 4 1.3 植物组织培养的主要难题 4 1.4 莲的概述 5 1.5 莲组织培养研究进展 6 1.6 研究目的和内容 7 第二章 材料与方法 8 2.1 实验材料 8 2.1.1 植物材料 8 2.1.2 实验试剂 8 2.1.3 实验器材 9 2.2 实验方法 9 2.2.1 技术路线 9 2.2.2 激素母液配制 10 2.2.3 培养基配制 10 2.2.4 外植体消毒 10 2.2.5 温光培养条件 11 2.2.6 防褐化方法 11 2.2.7 愈伤组织中生物碱提取 11 2.2.8 荧光定量PCR 11 第三章 结果与讨论 15 3.1 莲无菌苗培养 15 3.2 莲愈伤组织诱导 16 3.2.1 储藏莲子胚芽愈伤组织诱导 16 3.2.2 莲田间外植体材料愈伤组织诱导 17 3.2.3 无菌苗外植体材料愈伤组织诱导 19 3.3 愈伤组织继代及防褐化实验 20 3.4 莲生物碱合成基因的表达及愈伤组织中生物碱含量测定 21 第四章 结论与展望 23 4.1结论 23 4.2展望 23 参考文献 25 致谢 28 第一章 绪论 1.1 植物组织培养概述 植物组织培养是在植物学、细胞生物学、微生物无菌培养技术等基础上建立与发展起来的一项植物细胞工程技术。广义的植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物组织、器官或器官组件，在人工条件下培养，诱发产生愈伤组织或潜伏芽，或长成完整植株；狭义的植物组织培养则指利用离体的植物组织，如胚乳、形成层、叶肉组织、薄壁组织等进行培养，经诱导产生愈伤组织，并经再分化形成完整植株^[1]。 植物组织培养理论建立于二十世纪初期，1902年‘植物组织培养之父’著名的奥地利植物学家Gottlieb Haberlandt提出细胞全能性的理论。他认为，任何植物细胞在适宜条件下，均具有不断分裂、繁殖，发育成完整植株的潜力^[2]。实际上，直到1912年，法国科学家Alexis Carrel才第一次成功建立了动物的细胞培养体系，并因此获得了诺贝尔奖。之后，1934年科学家Gautheret RJ首次真正在植物上成功进行了组织培养，利用大槭树的形成层组织诱导得到了愈伤组织^[3]。随后，经过了几十年的艰难发展，植物组织培养到了二十世纪七十年代才开始商业化应用。 植物组织培养是在人工条件下进行的，理论上来自植物体的任何器官、组织、甚至于细胞都可以在合适条件下诱导培育出完整植株，相对于传统的育种、繁殖方法，具有很多无可比拟的优越性。首先，植物组织培养繁殖速度快，繁殖系数高。在自然条件下，对珍稀植物或具有较高经济价值植物的繁殖，常常被地理条件和季节所限制，难以实现高效、快速繁殖。利用植物组织培养，可以以数万倍甚至百万倍速度进行繁殖。特别是对一些自然繁殖系数低，还不能通过种子繁殖的名特优植物品种，意义尤为重大^[4]。其次，植物茎尖分生组织培养能获得完全脱毒幼苗。许多无性繁殖植物都带有病毒，如甘薯、大蒜、草莓、马铃薯等，严重影响农作物的产量和品质。但受病毒感染的植株茎尖生长点部位病毒浓度一般较低，甚至无病毒^[5]。切取植物茎尖进行培养，再生植株就可能不带病毒，从而获得脱毒苗。脱毒苗再进行扩大繁殖，种植的农作物基本不会发生病毒病症。第三，利用植物的组培再生体系，可实现对植物性状相关基因进行精准过表达或敲除。通过农杆菌介导的转染体系^[6]或Cas 9基因编辑体系^[7]，可对植物细胞定向转化抗生素抗性基因和目标基因，通过在培养基上进行抗生素选择，获得稳定的转基因再生植株。目前，利用植物组织培养的转基因体系已成为基因工程定向育种、基因功能研究的强大工具。第四，植物组织培养可工厂化批量生产药用天然活性产物。植物中草药是人类的宝贵财富，但很多中草药天然资源匮乏，自然生长缓慢，且易受自然灾害影响。从天然植物中提取次生代谢物难以满足日益增长的市场需求。利用培养的植物细胞作为生物反应器，可以合成多种次生代谢物，如薯蓣皂特、人参皂角苷和维斯纳精等，亦可合成特定蛋白、抗体、疫苗、抗生素等^[8]。此外，利用植物组织培养进行育种还可以克服植物远缘杂交的不亲和性，目前已经在单倍体育种、胚胎培养、细胞融合育种等领域取得较大进展^[9]。 1.2 植物组织培养主要技术要点 1.2.1 外植体选择 根据细胞全能性理论，植物的任何器官、组织，包括胚、茎尖、叶片、叶柄、块茎以及实生苗的嫩叶、下胚轴等都可选作组织培养的外植体。但不同物种，甚至同一物种的不同组织，对诱导条件的反应往往不一致。外植体可以分为两类，一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、幼胚等，可直接诱导培育产生丛芽，达到快繁育苗的目的^[10]。另一类是不带芽的外植体，如根、茎、叶等营养器官以及花药、花瓣、胚珠等生殖器官。这类外植体需经过脱分化产生愈伤组织，愈伤组织再分化，产生丛芽和根器官，并最终形成完整的再生植株。一般来说，应选择从种性优良、生长健壮、无病虫害且处于营养生长旺盛时期植物上切取外植体材料^[11]。 1.2.2 消毒方法 由于植物取材部位、母体植株生长环境、植物种类、取材季节和天气状况的差异性，采集的材料带菌情况不同，而且因不同材料对消毒剂敏感程度不同^[8]，要合理选择消毒剂种类、浓度大小以及消毒时间长短，这样才能保证既杀死离体材料表面的全部微生物，又不损伤或轻微损伤植物材料。目前常用的消毒剂有0.1%-0.5%氯化汞，0.7%-2%次氯酸钠，漂白粉，75%乙醇等，消毒好后材料应立即接种，避免二次污染。同时，部分植物可能含有内生菌，无论何种表面消毒剂均没办法彻底消除，因此还可以使用抗生素间接防治处理，理想的抗生素应具备不受培养基和pH的影响，具有杀菌性较稳定等特点。目前使用的抗生素有青霉素（20mg/L）、链霉素（10mg/L）、杆菌肽（50mg/L）等，单独使用一种抗生素通常效果较差，需要多种配合使用，但也要注意高浓度抗生素可能对外植体有毒害作用。 1.2.3 培养基 培养基是模仿土壤环境，给进行培养的细胞、组织或器官提供支持和营养生长环境。不同植物、甚至同一植物的不同组织，对营养的需求都不一样。因此，不存在单一的、能满足所以植物组织器官生长的培养基^[12]。开展植物组织培养，在选择好外植体材料后，首要任务就是探讨最适合植物组织生长需求的培养介质。 最早的培养基是White的生根培养基（1943）和Gautheret的愈伤组织生长培养基（1939）。White培养基优化自Uspenski和Uspenskaia的藻类植物培养基，而Gautheret培养基则源自于Knop的无机盐溶液。现在的培养基配方都是基于White和Gautheret培养基发展而来^[13]。培养基主要包含有植物生长需要的大量元素、微量元素、糖类、支持物等，并辅以植物生长调节剂、维生素、氨基酸等。 目前，MS培养基是使用最广泛的培养基^[12]。MS培养基无机盐浓度较高，不仅提供了组织生长所需的矿物质，还加速愈伤组织生长。由于培养基中离子浓度高，在配制过程中，即使某些成分有所差异，也不会影响总体上的离子平衡。MS固体培养基在愈伤组织诱导，培养胚、茎尖及花药中均有应用，而液体培养基多用于细胞悬浮培养。MS培养基中无机养分的数量和比例能支持植物细胞正常生长。因此，一般情况下，无需添加如酵母提取物、氨基酸、酪蛋白水解物等其它有机附加物质。 培养基配好后，一般调节pH值到5-6，再进行高压蒸汽灭菌。当培养基的pH值高于6时，培养基比较硬，而当pH值低于5时，培养基往往难以固化。配好的培养基，其pH值也不是固定不变的。高压蒸汽灭菌后，pH值会显著降低。接种植物组织后，培养基的pH值也会发生变化。当植物组织优先吸取氨态氮（NH₄ ）时，培养基的pH值降低；而当植物组织优先吸收硝态氮（NO₃^-）时，培养基的pH值则会升高。这种培养基pH的变化有时会影响植物对培养基种矿质元素的吸收利用。 1.2.4 激素配比 植物激素一般可以分为五大类。其中，赤霉素、乙烯类和生长抑制素类使用相对较少而生长素类和细胞分裂素类使用较为频繁。生长素类有很多种，主要包括吲哚乙酸（IAA）、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸（NAA）等，细胞分裂素类主要有6-苄氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）等。在植物组织培养过程中，这两类激素是影响细胞分裂、脱分化以及再分化的关键性激素，两者的比例影响植物细胞的生长发育方向。对于愈伤组织诱导而言，生长素类使用较多，由于2, 4-D对细胞有毒害作用^[14]，诱导的愈伤组织一般不易分化，且再生频率很低，一般优先使用NAA和IAA。诱导愈伤组织时还可以在培养基中添加少量的细胞分裂素类，如6-BA、KT等，可以促进细胞分裂，有利于愈伤组织的形态建成，还可以改善愈伤组织的质量^[15]。然而，对于愈伤组织继代培养，这两类激素的比值更为重要。在生根培养基中，生长素浓度一般要大于细胞分裂素浓度，生芽培养基则相反。总的来说，生长素类主要用于诱导植物细胞脱分化以及不定根的分化。细胞分裂素类主要用于诱导植物细胞再分化以及不定芽的分化。植物组织培养过程中，植物激素在培养基中使用量极低，一般在0.01mg/L到10 mg/L之间变化，但是必不可少。由于植物自身内源激素的存在，植物激素的使用量需要根据品种以及植物组织的变化而变化^[16]。不过，在植物组织培养过程中，可以通过改变植物激素的种类以及浓度来合理调控外植体的分化过程，最终获得再生植株^[17-18] 。 1.2.5 外植体培养环境 此外，外植体的培养环境，如温度、光照、光周期，甚至湿度也至关重要。植物细胞生长的最适温度为25-30℃，接种后植物组织培养的温度一般控制在23-27℃。组织培养一般不需要植物进行自营养生长，不需要很强的光照。光照强度300-500 Lux即可满足植物光周期的要求，1000-2000 Lux可以满足大部分植物组织正常生长需求。 1.3 植物组织培养的主要难题 组织培养常常会遇到各种难题，使实验无法继续进行，甚至导致实验失败，给科研或生产造成巨大损失。培养中存在的污染，褐化、玻璃化问题是植物组织培养过程中公认的三大难题^[19]。 在组织培养过程中污染时常发生。造成污染的病原体可分真菌和细菌两类。真菌性污染多因霉菌引起，一般由接种室内的空气污染、实验人员操作问题造成。改良培养环境、规范操作程序可减少此类污染，例如实验室中使用无菌操作设备：超净工作台；无菌操作者要严格要求自己，经历无菌操作训练并通过无菌操作考核后才可进行组织培养实验。细菌性污染多因培养基灭菌不完全或外植体带菌引起，对外植体带菌造成的污染与外植体种类、取材部位、预处理方式以及消毒方式等均密切相关。对外植体进行彻底消毒是控制组织培养过程中污染的前提。具体消毒方式，已在上文阐明。培养基灭菌一般使用高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min，不同培养基，灭菌方式略有不同。 褐变是指在外植体培养过程中由于细胞中酚类物质被氧化，生成褐色醌类物质，向培养基释放，导致培养基逐渐变成褐色，外植体也因此进一步变褐而死亡^[20]。在完整的组织和细胞中，多酚类物质主要分布在液泡内。当外植体进行愈伤组织诱导时，器官、组织等脱分化，使细胞膜的结构发生变化，细胞之间的分界线趋于模糊，为氧化酶与酚类化合物创造了接触的条件^[21]。在氧气存在的情况下，迅速氧化形成醌类化合物，进而与组织中蛋白质发生聚合，导致整个组织代谢紊乱，甚至死亡。防止褐变首先要选取合适的外植体。不同植物、不同品种发生褐化的情况不一样，外植体的年龄、大小、取材部位及受伤程度均能影响褐变情况。另外选择适宜的培养基、在培养基中加入抗氧化剂维生素C或吸附剂活性炭，外植体的频繁换板等都会有效遏止褐化 ^[9]。 玻璃化又称过度水化是指外植体在培养过程中呈现半透明玻璃状，组织结构发育畸形的现象。目前，外植体玻璃化的根本原因尚未明确，研究发现培养基种类、激素的种类、外植体选取以及培养条件变化等均会对组培苗玻璃化产生显著影响，因此采取克服玻璃化方法也要随原因的不同而有所变化，进行相应改善。