摘 要

目的：研究CD44基因的SNP位点rs187115与湖北人群中肺癌的易感性之间的关系。

方法：分别从800例正常对照人群以及550例肺癌患者的外周血细胞中提取基因组DNA，采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术检测每份基因组DNA的CD44基因内含子区的SNP位点rs187115的多态性。为了保证选取的样本群体具有代表性，通过哈迪-温伯格平衡定律证明了样本中的所有群体均为遗传平衡的群体。使用SPSS统计软件对实验结果进行统计学分析。

结果：这550例肺癌患者和800例正常对照人群的对比中G/A等位基因和GG/AG/AA基因型的分布有显著的差异，其中G vs. A（p=0.001）, GG vs. AA（p=0.002），AG vs. AA（p=0.052），CT vs. TT（p=0.993），GG vs. AG AA（p=0.006）， GG AG vs. AA（p=0.007），表明rs187115与湖北人群肺癌的易感性有显著联系。

结论：CD44基因内含子的rs187115位点与湖北人群肺癌的发病可能有相关性。

关键词：单核苷酸多态性；CD44基因；rs187115；肺癌；遗传易感性。

Abstract

Objective: To study the relationship between the SNP locus rs187115 of the CD44 gene and the susceptibility of lung cancer in Hubei population.

Methods: Genomic DNA was extracted from the peripheral blood cells of 800 normal controls and 550 lung cancer patients. Restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction was used to detect the intron rs187115of the CD44 gene in each genomic DNA sample. To ensure that the selected sample population is representative, all of the populations in the sample are genetically balanced by the Hardy-Weinberg equilibrium law. SPSS statistical software was used for statistical analysis of the experimental results.

Results: The results showed that there was a significant difference in the distribution of G/A alleles and GG/AG/AA genotypes in these 550 lung cancer patients and 800 normal controls. G vs. A (p=0.001), GG vs. AA (p=0.002), AG vs. AA (p=0.052), CT vs. TT (p=0.993), GG vs. AG AA (p=0.006), GG AG vs. AA (p= 0.007), indicating that rs187115 is significantly associated with the susceptibility of lung cancer in Hubei population.

Conclusion: The rs187115 locus of the CD44 gene intron may be associated with the pathogenesis of lung cancer in Hubei population.

Keywords: Single nucleotide polymorphism; CD44 gene; rs187115 locus; Lung cancer; Genetic susceptibility.

目录

第1章 绪论 1

1.1肺癌的现状 1

1.2 肺癌的分类 1

1.2.1 小细胞肺癌 2

1.2.2 肺腺癌 2

1.2.3 鳞状上皮细胞癌 2

1.2.4 大细胞癌 3

1.3 肺癌的发病因素 3

1.3.1 吸烟 3

1.3.2饮食营养因素 3

1.3.3 大气与环境污染 4

1.3.4遗传等因素 4

1.3.5 免疫状态 5

1.3.6激素与内分泌 5

1.4 癌症与细胞表面粘附分子的关系 5

1.4.1 CD44基因 5

1.5肺癌的遗传易感性研究 6

1.5.1单核苷酸多态性（SNPs , Single nucleotide polymorphisms） 6

1.5.2 SNPs的研究方法 6

1.6 研究的目的以及前景和展望 8

第2章 材料和方法 10

2.1 实验器材 10

2.2 主要试剂 10

2.3 样本采集 11

2.4 样本DNA的提取 11

2.5 DNA浓度及纯度检测 12

2.6 CD44基因部分序列的扩增以及RFLP-PCR法检测SNPs 12

2.6.1 CD44基因单核苷酸多态性的特点 12

2.6.2 PCR引物及酶切错配引物的设计 12

2.6.3 PCR反应条件 13

2.6.4 SNPs的酶切情况 13

2.6.5 DNA跑胶结果 13

第3章 结果 15

3.1肺癌患者与正常人基本情况对比 15

3.2基因分型结果 15

3.3基因型与肺癌发病关联度 16

3.4荟萃分析 16

第4章 讨论 18

第5章 结论 19

参考文献 20

致谢 22

第1章 绪论

在人类发展的历史长河中，科技与文明不断进步，人们的生活水平得到了显著提高，平均寿命也变得越来越长。癌症逐渐变成威胁人类生命健康的一大冷血杀手，困扰人类的重大疾病也随之发生了改变。大量的研究表明，癌症的发生与人所处的环境，生活习惯以及遗传因素等相关。近年来，随着生物学的研究不断深入，分子生物学和遗传学的研究取得了很大进步，人类在癌症方面的研究取得了许多新的进展。近年来，随着表观遗传学研究的兴起，癌症在这方面的研究愈加受到人们的关注。癌症具有许多典型的生物学特征，如癌细胞的分化和增殖会异常并且其生长失去控制以及具有浸润性和转移性等。因此，大多研究表明，肿瘤细胞中与细胞粘附分子相关的基因一般存在异常表达情况。位于人类11号染色体上的CD44基因编码细胞表面糖蛋白-CD44 ，该蛋白被广泛认为是骨桥蛋白和透明质酸盐的细胞表面受体，它介导细胞与细胞外基质（ECM）的粘附^[1]。本实验旨在研究CD44基因中的SNPs与肺癌之间的易感性的关系，从而为人类肺癌的诊断与治疗提供新的思路与方法。

1.1肺癌的现状

肺癌作为一种恶性肿瘤，在世界上是发病率和死亡率增长最迅速，对人类的生命健康威胁最大的癌症之一。近半个多世纪以来，许多国家和地区都报道称肺癌的发病率和死亡率都显著提高。其中，女性肺癌的发病率在所有癌症中占第二位，死亡率则占第二位，而男性无论是发病率还是死亡率都是排在首位。尽管有大量的研究资料显示肺癌与吸烟有着十分紧密的联系，但是对于肺癌的病因目前还是没有一个确定的结果。在19世纪初，肺癌才开始被人类详细地记录下来。然而，从20世纪50年代起，吸烟，环境污染等原因导致肺癌的发病率和死亡率节节攀升^[2]。直至2016年，中国癌症与预防控制中心公布， 过去一年中国人口调查发现，肺癌的发病率和致死率位于所有恶性肿瘤的首位，中国已经成为肺癌大国^[3]。而在湖北省，肺癌的发病率也在逐渐上升，在2014年的调查报告显示湖北人群肺癌的发病率为全国平均水平的两倍。在过去的一个世纪里，肺癌正悄悄地成为威胁人类健康的一位隐形杀手，其诊治方面也存在着许多的盲点以及困难。但是，经过国内外的众多科研工作者的潜心研究，肺癌的诊断和治疗手段已经有了很大发展，尤其是近几年出现的分子靶向治疗与免疫治疗，为人类今后攻克肺癌这一难题带来了新的希望^[2]。如果能够从分子层面找到与肿瘤相关的基因，将能够对病人进行更加有效地治疗。

1.2 肺癌的分类

肺癌可以分为四种主要的类型：首先分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者又可再进一步细分为大细胞癌、鳞状上皮细胞癌和肺腺癌。

1.2.1 小细胞肺癌

小细胞肺癌（SCLC）在所有肺癌中的比例约占20%~25%，根据近年来的流行病学的资料显示，这种类型已经有下降的趋势。其癌变的细胞是由肺嗜银细胞转化而成，后来世界卫生组织又将小细胞肺癌分为了三种：燕麦细胞型、混合细胞型以及中间细胞型。该种肺癌在男性比女性中更为常见，其发病的部位主要是肺大支气管。其癌细胞生长十分迅速，转移也迅速，且很容易产生抗药性。这类癌症大多是由吸烟所引起的，但是也与环境或基因有着一定的联系。小细胞肺癌的分期比较特别，可以分为局限期和扩散期：前者的癌细胞局限于局部淋巴结或半侧胸腔；而扩散期则会超越前者的范围，从而出现远端转移病灶。

作为一种未分化癌，小细胞肺癌的生物学行为非常恶劣，在预后十分凶险，是一种恶性程度非常高的肿瘤。如果在同样的传播范围来进行比较，小细胞肺癌与其他肺癌相比较而言，其在诊断前的症状期更短，在患者确诊之后的生存期亦更短。研究资料表明，假如患者在确诊后不进行治疗，其存活的时间不会超过一个季度，同时，该患者两年的存活率会小于1%，十分凶险。

1.2.2 肺腺癌

近年来的流行病学的调查结果显示，在许多国家（包括我国）的人群中，无论吸烟与否，肺腺癌患者几乎占了所有肺癌患者数目的一半其发生率已经超过了肺鳞癌。在一些国家，肺腺癌是青年人群肺癌患者中最为常见的病理类型，其中，女性该病的发病率近来出现倍数增长的现象。

肺腺癌共有四种亚型，即：浸润性腺癌、微浸润性腺癌、浸润前病变和浸润性腺癌的变异型。肺腺癌产生于支气管腺体，可以发生于各级的支气管，但是在小支气管最多。肺腺癌约有四分之三以上发生在周边，因此，以周围肿块较常见。在早期，其往往没有明显的症状，往往是在进行了胸部X线或者经过CT等检查才会被发现。尽管肺腺癌一般情况下生长较慢，但在有的时候，在早期就已经发生血性转移，而淋巴转移会发生在较晚。在有些情况下，肺腺癌表现为广泛转移或胸膜累积，预后不佳。

1.2.3 鳞状上皮细胞癌

鳞状上皮细胞癌约占3/10左右，多发生于男性吸烟群体，在早期从局部向外延伸转移，后期则是经由血路扩散。在年纪较大的男性中更为常见，且与吸烟有着密切的关系。中央型肺癌是鳞状上皮细胞癌中最为常见的一种，常导致支气管变窄以及阻塞性肺炎或者肺不张，并且，癌细胞慢慢会向管腔内生长。随着时间的推移，癌变组织会经历一个变性、坏死、形成空洞或者是癌性肺脓肿的过程。这种癌细胞的生长和转移比较慢，因此有较多的机会通过手术切除，但化疗放疗不如小细胞肺癌敏感。

近年来，癌症生物学家发生鳞状上皮细胞癌一些原因不明的变化。有研究者指出，鳞状上皮细胞癌有从气管里面向肺的周边扩散的趋势。与此类似的情况就是肺腺癌，以前患者肺腺癌细胞都是长在周边，但是现在也发现了长在中间的。由此可见，癌细胞并非一成不变的，可能还有我们所不知道的生存之道。

1.2.4 大细胞癌

大细胞肺癌患者人数约占肺癌的1/20，癌细胞生长速度较快，会迅速经由血路及淋巴扩散，很难治疗。肺大细胞癌也是一种未分化癌，这种癌细胞形态学特征不明显。其癌细胞的形态多种多样，较大，既不会发生角化，也不会形成腺泡或者产生黏液。大细胞癌非常少见，其多形成于肺的上叶，且为周边型，癌细胞体积明确，边界清楚，几乎没有空洞。大细胞肺癌也是一种恶性程度很高的肿瘤，因此治疗效果差，预后不良。

1.3 肺癌的发病因素

目前的研究认为，肺癌是一种多因素导致的癌症，既与患者所处的环境和生活方式相关，也与遗传等因素密切相关。

1.3.1 吸烟

目前，人们所公认的肺癌的病因之中，最重要的因素就是吸烟。烟草是由超过3000种化学物质构成的混合物，其中的大多数都具有很强的致癌性，如多链芳香烃类化合物和亚硝胺等。这两类化学物质可以通过多种机制最终导致支气管上皮细胞的DNA受到损伤，从而使得癌基因（如Ras基因）激活，抑癌基因失活，进一步引起细胞的转化，最终导致癌变。在环境因素引起的肺癌中只有1/5不是由吸烟引起的。吸烟者患肺癌死亡的概率约为不吸烟者的10倍以上^[4]。吸烟者的吸烟量与肺癌之间的剂量反应关系，以及戒烟后肺癌危险性下降的这一事实，更加说明吸烟在肺癌病因学中占有重要的地位。吸烟又分为主动吸烟和被动吸烟两种，被动吸烟和肺癌之间是否存在关系的研究结论目前尚不完全一致，但目前大多数研究认为被动吸烟也会明显增加患肺癌的危险性。

1.3.2饮食营养因素

目前，尽管关于饮酒与肺癌之间是否存在关联的研究结果还不一致，然而，仍然有许多人认为饮酒与肺癌的发生有着一定的联系，乙醛作为酒精的代谢产物被认为与肺癌的发生有关^[5]。日本的一项研究，通过对比了256例正常人和505例肺癌患者的乙醇代谢酶ADH3、ALDH2和CYP2E1这三个基因的多态性分析，随后发现当饮酒者的CYP2E1和ALDH3这两个基因变异时，肺癌的风险性会显著提高，即饮酒与肺癌显著相关^[6]。

此外，有研究发现人们饮食里面的的植物雌激素对肺癌的发生是有预防作用的，其他许多的科研结论亦表示通过食物摄入较多的植物雌激素可以有效降低患肺癌的风险。美国M.D.Anderson肿瘤中心的研究结果证明膳食中摄入的木酚素和异黄酮具有显著降低患肺癌风险的作用^[7]。另有其他研究证实在饮食中摄入牛奶/奶制品、蔬菜以及进行锻炼可以降低患肺癌的风险^[8]。

1.3.3 大气与环境污染

城市里，工业的发展、居民取暖及汽车的增加，导致现在的空气污染越来越严重。如今，肺癌患者的增加亦与空气污染有关。在我国北方典型的工业城市中，如沈阳、鞍山等地的人肺癌死亡率较高，这与大气污染可能有关。美国大学的学者证实美国肺腺癌的发生率在近50年内的增高亦与日趋严重的空气污染有关。

此外，对于女性而言，在烹饪时所使用的燃料以及因此产生的油烟是患肺癌的重要危险因素 ，而燃料的燃烧产物中含有多种致癌物质。Dalai的一项病例对照研究表明，肺癌中最普遍的类型是腺癌，这种癌症在不吸烟的女性患者中的比例更大。而在吸烟女性肺癌患者中，则以鳞癌和小细胞肺癌居多^[9]。另外，有研究证明在环境污染严重的城市里工作和生活的人，其患肺癌的概率显著要高于环境优美的乡村。其中，在环境污染中最为重要的危险因素是接触放射性同位素、芳香族化合物、制陶、砷、镍等。一些职业上必不可少的接触与肺癌的关系较大，目前多种工业产生的毒物或工作过程被认为为与肺癌有关。对采集锡矿工作的调查研究，发现工作环境中存在的氡子气、含砷粉尘等是工人容易患肺癌的重要原因，在采取措施后已经有所下降。除此之外，工作接触氯甲甲醚、无机砷、二氧化硅、芥子气等，也会加大患肺癌的风险。大量吸入放射性物质，长期接触煤气、微波辐射以及含放射性的金属矿等均可诱发肺癌。

1.3.4遗传等因素

肺癌的发生是环境致癌因素和人类个体对环境危险因素的易感性相互作用的结果。人们很早就提出肺癌具有家族聚集这一特点，后来英国学者的研究亦证明了这一说法^[10]。该研究对1999年到2004年之间的多例肺癌患者（女性）和对照的一级亲属患肺癌的情况进行了对比，实验结果显示患肺癌的风险与一级亲属患肺癌的人数呈正相关，对于家族史有患肺癌的不吸烟女性群体而言，其患肺癌的风险显著的增高。

基因的不稳定性与非小细胞肺癌的发生也具有相关性，研究表明DNA的损伤修复以及对苯并芘二醇环氧化物的敏感性与非小细胞肺癌的发生有关^[11]。除此之外，肺癌发生的过程中，遗传易感性与环境的相互作用亦具有十分重要的意义，分子流行病学研究发现，肺癌患者有一些基因发生了多态性的改变。而这一说法也得到了多项研究的支持。

1.3.5 免疫状态

在已有的研究中，证明人类的免疫状态也会对肺癌的发生产生一定的影响。挪威的一项关于肺癌的发生与肺炎之间的相关性的研究表明，肺炎患者在住院后的肺癌患病风险会显著增加，并且能够持续三年之久，这显示肺炎与肺癌之间可能是存在相关性的^[12]。目前，关于免疫与肺癌之间的性关系的研究尚少，需要进一步的研究揭示其内在联系。

1.3.6激素与内分泌

目前已有的研究发现，同样病理和分期的肺癌中，女性比男性预后要好，这可能与激素有关。美国的8所著名研究机构的研究结果表明，在非小细胞癌患者中，男性和女性患者都接受了同样的化疗，男性和女性患者的缓解率相同，但是女性的中位生存期比男性显著延长^[13]。另外，意大利的一项研究表明不同雌孕激素水平与女性肺腺癌的发生有关，目前仍然需要进一步的研究来揭示其的内部潜在的联系^[14]。

1.4 癌症与细胞表面粘附分子的关系

大量的研究表明，肺癌的发生不仅与生活习惯和环境有关，还与基因等遗传因素有关。如今非常热门的表观遗传学指的是研究在核苷酸序列不变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门学科。表观遗传学的研究包括DNA的甲基化、染色质重塑、基因组印记、染色体失活和非编码RNA等。近年来的研究资料显示，肺癌的发生与表观遗传学上基因的异常表达也有相关性。

癌症细胞的一个主要的特点就是具有病灶转移的特性，研究表明，癌细胞形态发生了很大变化，细胞之间的粘附和识别变弱。近年来的研究表明，癌细胞表面的粘附分子相关基因的表达亦存在异常。

1.4.1 CD44基因

CD44基因能指导合成CD44蛋白，其定位于人类11号染色体的短臂，全长约50kb，由多个外显子组成，它们都异常保守，其长度从几十到几百不等，相邻的外显子之间是大小不等的内含子。根据转录方式的不同可以将这些外显子分为组成型外显子（用C表示）和变异型拼接外显子（用V表示）两大类。其中组成型外显子约占一半，其存在于所有的转录产物之中。人们把不含有拼接型外显子的CD44基因的转录产物称为标准的CD44（CD44S），其编码由361个氨基酸组成的蛋白质。CD44蛋白在加工成熟之后便没有信号肽区，经过翻译后的糖基化等修饰，CD44S蛋白质分子量可达近100KD，CD44蛋白可与细胞表面的透明质酸结合，在淋巴细胞回归以及引流淋巴结中具有十分重要的意义。拼接外显子位于第5、6位组成型外显子之间，总长为1245bp，含有这种拼接外显子的CD44基因的转录产物称为CD44V。CD44V既可以可连续性的转录，也可以跳跃性转录。每次的转录过程中参加拼接的外显子数目不定，因此转录片段的长短也不一。