摘 要

目的：研究POL2E基因上多态性位点rs3787016与湖北省人群中甲状腺乳头状癌发生的易感性。

方法与结果：提取甲状腺乳头状癌患者以及正常人群的外周血细胞基因组DNA，采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术检测408例甲状腺癌患者和800例正常对照组中POLR2E基因rs3787016多态性位点的分布。使用Hardy-weinberg 定律验证所检测样本群体均为遗传平衡群体，抽样具有代表性。继而使用SPSS 软件对分型结果进行统计学分析。结果显示，在甲状腺乳头状癌中,rs3787016与甲状腺乳头状癌患病显著相关，其中在甲状腺乳头状癌患者组等位基因的分布情况为C(34.8%)和T(65.2%)，在正常人群中等位基因分布为C(41.5%)和T(58.5%)。POLR2E rs3787016在甲状腺乳头状癌中基因型频率分布分别为TT型为0.428，TC型为0.447，CC型为0.125，在正常人群基因型频率分布分别为TT型为0.358，TC型为0.455，CC型为0.188. Bonferroni校正多重检验后得到plt;0.008（0.05/6），结果显示甲状腺乳头状癌患者rs937283 T等位基因频率显著高于正常对照组水平（p=0.002，OR=1.33，95%=1.11-1.58），表明等位基因T与甲状腺乳头状癌风险增加有关。同时，在后续的荟萃分析中进一步显示，POLR2E rs3787016 T等位基因与中国人群患癌风险增加有关。

结论：POLR2E基因的rs3787016位点与湖北人群甲状腺乳头状癌的发病具有显著的相关性。

关键词：单核苷酸多态性；长链非编码 RNA ；甲状腺乳头状癌；POLR2E；遗传易感性

Abstract

Objective: To find the relationship between the polymorphisms of rs3787016 in POLR2E gene in papillary thyroid carcinoma in Hubei province.

Methods and Results: First, sampling was performed to extract peripheral blood cell genomic DNA from patients with papillary thyroid carcinoma and normal controls. Polymerase chain reaction (PCR-RFLP) was used to analyze the allelic and genotypic polymorphisms of rs3787016 in 408 thyroid cancer patients and 800 normal controls. Hardy-weinberg's equilibrium assumption was used to test the observed and expected allele and genotype frequencies using X2 text. And the result showed that each sample group is a genetically balanced group. SPSS software package was performed for statistical analysis of experimental results. The results showed that rs3787016 was significantly associated with thyroid papillary carcinoma. The distribution of alleles in the thyroid papillary carcinoma group was C (0.348)-T (0.652), and in the normal population the gene distribution was C(0.415)-T(0.585). The genotype frequencies of POLR2E rs3787016 in thyroid papillary carcinoma were 0.428 for TT, 0.447 for TC, and 0.125 for CC. The distribution of genotype frequency in the normal population was TT type 0.358 and TC type 0.455, respectively. It was 0.188. P lt; 0.008 (0.05/6) after Bonferroni corrected multiple test. The results showed that the frequency of rs937283 T allele in thyroid papillary carcinoma was significantly higher than that in the normal control group (p=0.002, OR=1.33, 95% =1.11-1.58), indicating that allele T is associated with an increased risk of thyroid papillary carcinoma. At the same time, the subsequent meta-analysis further showed that the POLR2E rs3787016 T allele is associated with an increased risk of cancer in the Chinese population.

Conclusion:

The rs3787016 locus of POLR2E gene has a significant correlation with the incidence of papillary thyroid carcinoma in Hubei population.

Key words: SNPs; LncRNAs; papillary thyroid carcinoma; POLR2E; genetic susceptibility

目录

第一章 绪论 1

1.1 甲状腺癌的现状 1

1.2 甲状腺癌的发病因素 2

1.3 癌症与长链非编码 RNA(LncRNAs)的联系 2

1.3.1 长链非编码 RNA(LncRNAs)的表观遗传调控原理 3

1.3.2 长链非编码RNA与癌症 3

1.3.3 长链非编码RNA POLR2E与RNA聚合酶II 4

1.4 癌症的遗传易感性研究 5

1.5 研究目的与前景展望 6

第二章 材料和方法 8

2.1 实验器材 8

2.2 主要试剂 8

2.3 样本采集 9

2.4 样本 DNA 的提取 10

2.5 DNA 浓度及纯度检测 11

2.6 POLR2E 基因部分序列的扩增及 PCR-RFLP 法检测 SNPs 11

2.6.1 POLR2E基因各单核苷酸多态性的特点 11

2.6.2 PCR 引物及酶切错配引物的设计 11

2.6.3 PCR 反应条件 11

2.6.4 SNPs 的酶切情况 12

2.6.5 DNA跑胶结果 12

第三章 结果 14

3.1 等位基因频率及基因型分布结果 14

3.2 变量分层分析结果 14

3.3 荟萃分析 15

第四章 讨论 18

第五章 结论 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 绪论

伴随人类历史，癌症始终是严重威胁人类的生命健康强大杀手^[1]，而甲状腺癌是人类头颈部恶性肿瘤中发病率最高的一种恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲状腺癌中最常见的一种^[2][3]。随着现代医学的迅速发展，诸如手术切除和放射性碘（RAI）治疗等高效治疗已应用于PTC治疗^[4][5]。大量研究表明，近年来PTC发病率和死亡率均逐年上升。调查显示，患者的生活、工作环境，饮食条件和习惯，环境污染，遗传以及慢性疾病等因素与恶性肿瘤的发生显著相关^[6]。近十年来，对于遗传学和分子生物学的探索研究逐渐深入，癌症的表观遗传学研究成为近年来的热点。根据近几年的研究发现，长链非编码RNA(Long noncoding RNA, lncRNA)中的SNP在肿瘤的发生中发挥重要的作用^[7][8]。LncRNAs是一类新的非编码调控RNA，长度从200 bp到100 kb不等。 尽管它们不具有开放阅读框和潜在的蛋白质翻译能力，但它们在调节细胞周期，细胞分化，基因印迹，染色质重构剂量补偿，基因组重排和基因表达调控等不同的生物过程中均发挥重要作用。 LncRNAs中的SNP可能会修饰参与致癌作用的各种生物途径的功能，因此对LncRNAs中的SNP的研究可以为癌症的诊断、治疗和预后提供新的参考^[9][10]。本工作拟检测POLR2E基因上的rs3787016位点的多态性在湖北地区甲状腺癌人群与正常对照组中的分布，探寻其与甲状腺癌发生的相关性。

• 1. 甲状腺癌的现状

甲状腺癌是内分泌系统中非常常见的癌症，近些年来发病率在世界范围内大幅上升，在韩国等地区已经成为女性患病增长率最高的恶性肿瘤^[11]。虽然甲状腺癌发病率不及肺癌和胃癌，但近十年来，国内外的甲状腺癌发病率呈现快速增长的趋势，不同类型及不同分期的甲状腺癌病例数量不断增多。仅2011年，美国就有超过48000例甲状腺癌患者，当年全球范围确诊至少200000例甲状腺患者，2012年，世界范围内新诊断出的甲状腺癌患者达到298000例，并且当年有40000例死亡患者。根据中国2013年登记在册的肿瘤数据，2010年间全国的甲状腺癌患病率达到4.12/10万，其中男性患病率为1.93/10万，女性患病率为6.42/10万。作为世界上最大的发展中国家，中国的医疗水平以及公民健康意识与发达国家相比还有不小的差距，因而类似中国这样的发展中国家甲状腺癌患者的存活率相对较低。数据还显示，仅在2010年，中国甲状腺癌死亡率达到0.34/10万，其中男性患者死亡率为0.23/10万，女性为0.46/10万。我国的甲状腺癌呈现明显的地区分布，我国甲状腺癌死亡率东部区域最高，西部区域较低，中部区域死亡率最低，此外城市区域甲状腺癌发病率和死亡率都高于农村区域。根据《2012中国肿瘤登记年报》的数据，我国城市中大连市甲状腺癌的患病率最高，农村中福建长乐市的发病率最低。我国女性患甲状腺癌的几率明显高于男性，其中城市男女性别甲状腺癌患病率比为1:3.2，农村男女性别甲状腺癌患病率比为1:3.85。此外，我国甲状腺癌发病还呈现明显的年龄分布特点，女性患病率自15岁起快速提升，在45-54岁年龄区间患病率达到最大值；男性自15岁起患病率缓慢提升，60-64岁年龄区间内达到最大值。有研究表明，如果能在较早的时期诊断癌症，并且及时进行手术治疗，那么患者的5年生存率将显著提高。因此，对甲状腺癌的早期准确诊断非常重要^[11][12][13]。在所有种类的甲状腺癌中，最为常见的是甲状腺乳头状癌，占甲状腺癌所有病例的80%以上。近几十年中PTC的患病率增长最快，这也是甲状腺癌发病率快速上升的主要原因^[14]。因此，对PTC发病机制的研究是一项非常重要的课题。

• 1. 甲状腺癌的发病因素

比起其他恶性肿瘤，甲状腺癌患者发病年龄相对较小，总体发病率随年龄的增大而上升^[15]。到目前为止，甲状腺癌的病因尚不明确，不过根据国内外甲状腺癌在地区、性别等类别上的分布差异可以推断出一些致病因素。例如，电离辐射是目前为止最明确的致病因素，切尔诺核电站事件后，调查处理核废料的工作人员发现，经受电离辐射后，成人的甲状腺癌发病率有所上升。由于碘元素对甲状腺的健康至关重要，因此碘元素的摄取异常也可能导致甲状腺癌的发生。资料显示，缺碘地区和高碘地区的人群甲状腺癌发病率均高于正常区域，缺碘地区人群滤泡状甲状腺癌（follicular thyroid cancer，FTC）发病率较高，高碘地区人群的乳头状甲状腺癌（PTC）患病率较高，当缺碘因素和电离辐射同时发生时，甲状腺癌发病率会明显上升。

部分内源性因素可能也会促成甲状腺癌的发生^[16]。有资料表明，甲状腺腺体自身的病变会影响患者的免疫功能，因而与甲状腺癌的发生有关。大量资料表明，促甲状腺激素（TSH）长期大量分泌以及TSH受体cAMP合成过多，会促进甲状腺细胞的生长，从而增加甲状腺癌的患病风险。有些调查还显示，生育期妇女的甲状腺癌发病率明显高于同年龄段的男性，目前已发现甲状腺组织中有雌性激素的表达，故有观点认为雌激素的分泌是甲状腺癌的一个重要诱因。此外，遗传因素在甲状腺肿瘤患病过程中也发挥重要作用，例如家族性甲状腺髓样癌（FMTC）、家族性甲状腺非髓样癌（FNMTC）就是探明的遗传性内分泌癌症。

从癌症的表观遗传学角度分析，癌症的发生是因为原癌基因与抑癌基因共同作用的多阶段慢性过程。根据目前的研究资料显示，长链非编码RNA在细胞中的作用与癌症的发生以及后续的发展有重要的联系。近些年来的研究显示，癌症的遗传易感性和LncRNAs中的SNPs有一定的相关性，SNPs会导致不同基因型的人群对癌症的易感性产生差异。因此，对SNPs和LncRNAs及其调控的酶合成过程进行相关探索，这将为癌症的早期诊断以及癌症病发的分子机理研究提供重要的参考。

• 1. 癌症与长链非编码 RNA(LncRNAs)的联系
     1. 长链非编码 RNA(LncRNAs)的表观遗传调控原理

非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指那些无不能翻译成多肽的RNA。根据RNA条带的长度不同，短于200nt的叫小非编码RNA (small ncRNAs，sncRNAs)，长度大于200nt的称为长链非编码RNA (long ncRNAs，LncRNAs)。LncRNAs没有开放阅读框，也没有潜在的编码蛋白质的能力。比起编码蛋白质的RNA，大部分LncRNAs也是由RNA聚合酶Ⅱ催化而生成，不过研究发现LncRNAs的保守性较低，并且具有组织特异性以及时空特性，在不同的组织里LncRNAs的表达量不同，即使在同一组织，不同时期表达的LncRNAs也不同。LncRNAs的作用非常广泛，作用机制也很复杂，它们在X染色体沉默、mRNA的拼接合成，细胞分化，核内运输，基因印迹，染色质修饰，转录激活，基因组重排和基因表达调控等不同生物过程中发挥重要作用。从基因的表观遗传调控角度看，LncRNAs是一类特殊的RNA，它们可以与同源DNA序列以及RNA序列轻松结合。LncRNAs的核苷酸链易于折叠，容易形成复杂的二级结构，可以轻松的与多种蛋白质结合。

在LncRNAs参与的转录前调控过程中，主要是对染色质开闭状态的调控，染色质的状态由表观修饰因子控制，而表观修饰因子的本质是蛋白质，因此LncRNAs可以一部分区域与DNA分子结合，其他部分折叠成相应的高级结构与表观遗传因子结合，从而抑制目的基因的转录。LncRNAs还可以与特定的基因结合，如Xist (X染色体失活特异转录本，X chromosome inactivation specific transcript)，并募集特定的抑制性表观因子(如CTCF、DNMT、EED）从而催化DNA的甲基化过程。此外，有一些LncRNAs在转录时会引起转录位点的染色体结构松散化，为转录复合物的进入提供便利，促进基因的表达。

在转录过程中，LncRNAs也发挥重要作用。RNA聚合酶II参与的II类启动子转录过程主要分成起始、延伸和终止3个过程。在这三个过程中，均出现了蛋白质与DNA分子的互作现象，因此LncRNAs可以与增强子结合控制转录因子TFs与增强子的相互结合的过程从而调控增强子的活性，也可以抑制启动子与RNA pol II复合体的结合来完成转录干扰，还可以凭借其与DNA分子的相似性，通过竞争捕获TFs来实现对转录因子活性的控制作用。

由于LncRNAs可以轻松与RNA分子结合，因此可以想到LncRNAs在转录后调控过程中也会出现。在mRNA剪切过程中，LncRNAs的结合会覆盖部分剪切位点，从而抑制切割。在mRNA转运过程中，LncRNAs结合的mRNA会受到限制，无法转运，从而失活。此外，LncRNAs可以与目标RNA结合从而改变其结构稳定性，使其更加易于降解或者更加稳定。

有研究表明，LncRNAs还可以调控mRNA的翻译、蛋白质翻译后修饰过程以及定位过程。上述部分仅是目前已探明的LncRNAs部分功能，自上世纪80年代被发现以来，LncRNAs的大量新功能正在不断地被发现。

• • 1. 长链非编码RNA与癌症

癌症是一类细胞增殖异常引起的疾病，而细胞增殖异常的原因有很多，目前尚未探明癌症具体的引发机制。大量研究表明，在癌细胞中发现了越来越多的LncRNAs表达异常，这提示我们LncRNAs可能是潜在的致癌因子（或抑癌因子）^[8]。此外，在已发现的许多致癌位点，也是由一些特殊的LncRNAs转录生成。随着基因芯片技术和高通量技术的迅猛发展，越来越多的与肿瘤相关的LncRNAs已被鉴定出来。在常见的癌症中，LncRNAs的功能很复杂，它们可以促进或者抑制癌细胞的生成。当正常细胞中LncRNAs发生改变或表达异常时，往往伴随着细胞癌变的一些病理特征，因此LncRNAs分子可以作为肿瘤预防及治疗的标志物。例如H19是第一个被发现的与癌症有关的LncRNA，它在肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞中表达量超出正常量，这表明H19可能参与肿瘤的发生^[7]。在DNA发生损伤时，有一些LncRNAs参与了修复过程，例如p53为保持细胞的稳定，会启动肿瘤抑制机制，这个阶段有许多LncRNAs的参与，如LncRNA Trp53corl能够与Hnrnpk相互作用放大p53依赖性转录抑制过程，最终引起细胞凋亡。

LncRNAs在调节生理过程方面具有重要的作用，这也启示我们可以针对具有特异性的LncRNAs开发新型药物，例如在应用于小鼠天使人综合征案例中，通过反义寡核苷酸（ASOs）来完成对LncRNA的抑制。

• • 1. 长链非编码RNA POLR2E与RNA聚合酶II

长链非编码RNA POLR2E