1. 研究目的与意义（文献综述）

phanerochaete chrysosporiurn是一类典型的具有较强有机物降解能力和环境友好的丝状白腐真菌。白腐真菌是腐生在木质上，引起其组分分解而导致木质腐烂的真菌，是木腐真菌中对木质素降解能力最强的成员，是已知的能在纯培养中将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一的一类生物。凭借其选择性降解木素纤维素的能力，白腐真菌的菌丝穿入木质，侵入木质细胞腔内，释放降解木质素和其他木质组分的酶，致木质腐烂成为淡色的海绵状团块白腐，白腐真菌由此而得名。

近年来越来越多的研究表明，白腐真菌能降解其它微生物无法或很难降解的污染物，尤其是能降解某些含有芳香环的和毒性较大的污染物，被认为是环境保护的一支奇兵。以目前国内外研究最多的典型黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporiμm)为例，已报道了用它对多环芳烃、ddt、tnt、cci、氰化物、氯代芳香化合物、酚类、胺类、农药、染料、杂酚油、煤焦油、重油等进行降解的研究。近年来，利用黄孢原毛平革菌处理重金属污染是国内外研究的热点。

黄孢原毛平革菌在氮、碳、硫硫等营养物限制条件下能产生特殊的酶系,包括漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶等,这些酶能有效降解各种异生物质。黄孢原毛平革菌降解这些污染物的关键在于其分泌的这些独特地胞外酶及其自由基降解机制。这种以自由基为基础的链反应过程具高度非特异性和无立体选择性,而且酶与底物非一对一的关系,因此使得黄孢原毛平革菌具有非专一性、广谱性特特点。其中对黄孢原毛平革菌的酶系研究比较多的是过氧化物酶和漆酶等。

2. 研究的基本内容与方案

1. 设计的基本内容、目标：纳米粒子广泛应用于生物物质的吸附分离、离子交换剂、非均相催化等领域。而二氧化硅纳米粒子具有生物相容性好，比表面积大，表面电荷可控，易制备等优点，被广泛用于生物领域研究。Phanerochaete chrysosporiurn是一类典型的具有较强有机物降解能力和环境友好的丝状白腐真菌，其广泛用于水体治理、工业废水治理等应用领域。本研究采用Phanerochaete chrysosporiurn和二氧化硅纳米粒子复合体进行产酶研究。本研究采用醇盐水解沉淀法制备二氧化硅纳纳米粒子。本研究将探讨Phanerochaete chrysosporiurn和二氧化硅纳米粒子复合体产酶行为特性。

   实验的主要内容包括：纳米二氧化硅的制备及其结构表征，主要适用的技术包括场发射电子扫描成像技术，TEM技术等；培养基的配制，菌种的培养，复合体构建；Phanerochaete chrysosporiurn和二氧化硅复合体的生长特性，发酵过程中发酵液的流变特性的变化，复合体菌丝球结构的表征包括菌丝及球体的光学成像、固定化球体的切片表征，生物量的测定，蛋白质的酶活测定，染料的配制，光谱分析，光度测定，动力学模型的建立及影响分析。

2. 拟采取的技术方案及措施：

1. 采用醇盐水解沉淀法制备二氧化硅纳纳米粒子

2. 黄孢原毛平革菌的培养、构建hanerochaete chrysosporiurn和二氧化硅复合体

3. Phanerochaete chrysosporiurn和二氧化硅复合体的生长特性：经摇瓶培养绘制生长曲线

4. 生物量的测定：选用干重测定法对黄孢原毛平革菌进行生长量的测定。其方法为：用60℃干燥箱烘干至恒重后，用称重的滤纸来过滤培养液。由于黄孢原毛平革菌菌丝附着在锥形瓶壁上，用蒸馏水洗涤干净并过滤；用蒸馏水洗涤过滤物除去培养基成分后，转移到培养皿中，另取一干净滤纸密封培养皿，置60℃干燥箱烘干6h 后，称重。

5. 发酵过程中发酵液的流变特性的变化：研究发酵体的流变性是一个相当复杂的过程随着研究的深入, 人们发现相比生物量, 菌体形态 (特别是团簇状菌丝体) 对流变性具有同样重要的影响^[36]。Thomas等定义了单位重量的生物干重对流变参数的数值为X_BDM;研究认为, 菌体形态参数如粗糙度 (Roughness) R与致密度 (Compactness) C对菌体的流变性影响最为显著^[37], 得到菌体形态与流变性的关系模型:

   
   

6. 复合体菌丝球结构的表征：丝状真菌菌丝体形态特征最常见的分析方法有直接观测法、图像分析法等。图像分析法的基本步骤：,显微图像拍摄显微图像分区、目标定位、检测与分析等借助图像分析系统,目前可用于描述菌丝体形态学特征的参数有菌丝长度、菌丝体面积、周长、紧密度、分枝频率等,其中菌丝球可以选用直径、长轴、短轴、周长、面积以及面积比等作为量化描述的参数。

7. 复合体产酶培养条件： p H4.5、葡萄糖: log /L、酒石酸胺: 0.2g /L、吐温- 80: 0.2g /L，产酶温度控制在30℃，培养温度控制在34℃。

8. 蛋白质酶活性的检测：胞外过氧化物酶系统的酶活测定采用的是紫外分光光度法。缓冲环境下，木质素过氧化物酶活性测量体系中，藜芦醇（VA）作为底物；锰过氧化酶活性测量体系中，以 Mn2 作为底物；两者添加 H2O2用于启动反应。实验每隔 12 h 取样，粗酶液使用 0.45 um滤膜过滤后，利用紫外分光光度计测定过氧化物酶的活性。

3. 研究计划与安排

第1-2周：根据论文题目中所要达到的目的初步确定实验方案、所需试剂和设备器材，合理分配时间。查阅与论文题目相关文献资料，完成毕业论文开题报告及任务书。

第3-4周：按设计要求装配设备，清洗培养皿等玻璃仪器。做好实验前准备工作，方便后续实验。

第5-6周：熟悉操作流程，总结操作经验。视实验周期及实验状况而定，条件允许可多进行几次。要求把握好时间间隔，准确测量，及时做好实验相关记录。

4. 参考文献（12篇以上）

1. 杨晓宽,杜连祥，路福平.白腐菌产锰过氧化物酶培养基的优化(j).生物技术，第14卷第3期:49-50.

2. 蒋晓云，曾光明，黄国和等.白腐菌的研究进展及其在重金属修复中的展望（j）.中国生物工程杂志，2005：118-121.

3. 许飘.磁性纳米固定化黄孢原毛平革菌对铅离子的吸附及其机理研究（z）.

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