摘 要

群体感应效应是细菌与细菌之间的通讯交流机制，是通过分泌小分子化学物质作为信号分子，在其到达某一浓度时诱导细菌中特异性基因表达的机制。N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）是革兰氏阴性菌中最具特征的细胞-细胞通讯信号，降解AHLs可有效抑制细菌群感效益，达到治疗感染的功效。AidH是来自Ochrobactrum sp. 的alpha;/beta;水解酶折叠家族成员的一种新型N-酰基高丝氨酸内酯酶，具有水解AHL内酯环酯键的作用，在破坏群体感应效益、预防和治疗感染方面具有很大的前景。

本研究利用冰核蛋白（INP）在大肠杆菌表面展示AidH蛋白，将AidH的N端和INP N-端结构域的C端连接构成细菌表面展示载体，探索出适合的表达条件，利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达含有INP-AidH重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，结果表明INP-AidH高效表达，可用于提取该重组蛋白进行活性测定。本文利用产生紫色色素而自身不分泌AHL ，只有在遇到外源AHL才显示紫色的缺陷型Chromobacterium violaceum CV026菌作为指示菌，以C6-HSL为外源AHL，对重组蛋白进行活性测定，结果显示C6-HSL经重组蛋白处理后，相比于对照组紫色色素的面积减少，且随着处理时间的增加紫色色素面积越少，表明INP-AidH蛋白确实具有降解AHL的活性。利用24孔板吸附生物膜的形成，发现铜绿单胞杆菌PA01在经INP-AidH蛋白处理后，相比于对照组，其生物膜形成的含量减少，这表明INP-AidH蛋白具有抑制生物膜形成的功能。在低温低压的条件，利用硅胶吸附位于细胞膜上的INP-AidH蛋白，通过对其进行C6-HSL降解能力的定性实验，结果显示处理后的硅胶颗粒具有良好的降解活性，同时对硅胶颗粒进行SEM及EDS扫描，发现实验组相比于对照组含氮量明显提高，这一实验结果为探讨新的抗菌策略提供了新思路。

关键词：群体感应效应；内酯酶；冰核蛋白；CV026；生物膜。

Abstract

Quorum sensing is a communication mechanism between bacteria and bacteria. It is a mechanism that secretes small molecules of chemicals as signaling molecules to induce specific gene expression in bacteria when they reach a certain concentration. N-acyl homoserine lactones (AHLs) are the most characteristic cell-cell communication signals of Gram-negative bacteria. Degradation of AHLs can effectively inhibit bacterial quorum sensing and achieve the efficacy of treating infections. AidH is a new N-acyl homoserine lactone from Ochrobactrum sp. which belongs to the folding family of alpha;/beta;hydrolases. It can hydrolyze the cyclic ester bonds of AHL lactones and has great prospects in destroying the quorum sensing benefits, preventing and treating infections.

In this study, Ice nucleation protein (INP) was used to display AidH protein on the surface of E. coli. The N-terminal of AidH and C-terminal of INP N-terminal domain were connected to form bacterial surface display vector. The suitable expression conditions were explored and use IPTG to induce the expression of E. coli BL21 (DE3) containing INP-AidH recombinant plasmid. The results showed that INP-AidH was highly expressed and the recombinant protein was extracted for activity determination. In this paper, the activity of recombinant protein INP-AidH was determined by using C6-HSL as exogenous AHL and the defected Chromobacterium violaceum CV026 strain which produced purple pigments when exist AHL but did not secrete AHL by itself was used as indicative bacteria. The results showed that the area of purple pigments of C6-HSL treated with recombinant protein decreased compared with that of control group, and the area of purple pigments decreased with the increase of treatment time, indicating that INP-AidH proteins have the activity of degrading AHL and less the area of purple pigments. Using 24-well plate to absorb the formation of biofilm, it was found that through the action of INP-AidH protein, the formation of biofilm by Pseudomonas aeruginosa PA01 has decreased compared with the control group, which indicated that INP-AidH protein had the function of inhibiting the formation of biofilm. Under the condition of low temperature and low pressure, INP-AidH protein on cell membrane was adsorbed by silica gel, and the degradation ability of C6-HSL was qualitatively tested. The results showed that the treated silica gel particles had good degradation activity. At the same time, SEM and EDS scanning of the silica gel particles showed that the nitrogen content of the experimental group was significantly higher than that of the control group. This experiment can provides a new idea for exploring new antimicrobial strategies.

Key words: Quorum sensing;Lactonase; Ice nucleation protein; CV026; Biofilm.

目录

第1章 绪论 1

1.1 群体感应 1

1.2细菌表面展示技术 1

1.3 INP-AidH蛋白 2

1.3.1 AidH蛋白的结构 2

1.3.2 INP-AidH蛋白的功能 2

1.3.3 INP-AidH蛋白与固定化 3

1.4 本研究目的、内容及意义 3

第2章 材料与方法 5

2.1材料 5

2.1.1 菌株、质粒及引物 5

2.1.2 主要仪器和试剂 5

2.2方法 8

2.2.1 重组质粒pET28a-INP-AidH的构建 8

2.2.2 重组蛋白INP-AidH的表达条件的选择 10

2.2.3 重组蛋白的纯化 10

2.2.4 INP-AidH在降解群感信号中功效的研究 11

2.2.5 INP-AidH在抑制生物膜方面的功效研究 11

2.2.6 INP-AidH的固定化及功效研究 12

第3章 结果与讨论 13

3.1重组质粒pET28a-INP-AidH的构建 13

3.2 重组蛋白表达条件的选择 14

3.3 重组蛋白的提取 16

3.4 INP-AidH在降解群感信号中的功效 16

3.5 INP-AidH在抑制生物膜形成中的功效 17

3.6 INP-AidH固定化效果 18

3.7 本章小结及讨论 18

第4章 总结与展望 20

参考文献 21

致谢 23

第1章 绪论

1.1 群体感应

群体感应效应（Quorum Sensing）是细菌之间的一种交流通讯机制，是细菌用来协调群体行为的细胞间通讯过程^[1]。细菌在生长繁殖的过程中不断向外分泌小分子化学物质，且其浓度随着群体密度的上升而上升，可以通过检测该信号分子的浓度而知道群体密度的变化^[2]。当分泌的群感信号分子的达到一定程度时，细菌生物膜通过检测周围细菌群体的数量和浓度，通过相应的信号分子，诱导细菌特异基因的表达^[3]，从而控制细菌群体的行为或生理化学特征的改变，例如致病菌的致病力、生物膜的形成以及运动细菌的运动等等^[4,5]，调控细菌的生命活动，从而表现出单独一个细菌无法表现出的生理功能。QS只有在细菌密度达到一定程度时才会发生，目前，诸多研究发现，细菌群体感应的信号分子可以分为3类，第一类是AHLs类及其衍生物，主要作用于革兰氏阴性菌中；第二类氨基酸以及短肽类，是主要作用于革兰氏阳性菌；第三类是呋喃硼酸酯类，在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均存在^[6]。因此，对细菌QS 系统的研究受到免疫学、医疗器械、生态学、食品安全等领域研究者越来越多的关注。

通过淬灭细菌群体感应的方法，降解群感信号分子，达到抑制细菌的运动及生物膜的形成等效果，实现抑菌的目的^[7]。群体感应所控制的特异性基因表达一般是于细菌致病力、生物膜形成等有关^[8]，因此通过对群感信号分子的淬灭，可以抑制细菌群体感应及其所带来的后果。按照机制的不同，抑制细菌群体感应的方法常用的有如下几种：（1）利用信号分子类似物竞争受体位点；（2）信号分子降解酶降解群体感应信号；（3）利用信号受体激活剂/抑制剂、关键蛋白激活剂/抑制剂等。相比于传统抑菌方法，这一方法从细菌群体感应的淬灭来达到抑制细菌群体行为的效果，极大地避免了诸如细菌出现抗生素耐药性等的现象。目前，细菌的群体感应淬灭已被广泛研究。

1.2细菌表面展示技术

细胞表面是细胞内外之间的功能界面。在生物技术中，可以通过将异种蛋白转移到细胞表面的机制加以利用。细菌表面展示是目前三种主要的微生物细胞表面展示的一种^[9]。细菌的表面展示是指将目的蛋白的基因与表达在细菌表面的靶蛋白的基因连接，再导入细菌体内进行诱导表达，诱导后的目的蛋白随着靶蛋白表达而存在于细菌表面。利用细菌表面展示外源蛋白，虽然往往会破坏细菌外膜蛋白而导致表面显示效率降低，但是对于外源蛋白而言能更好促使外源蛋白正确折叠和防止蛋白酶消化外源蛋白等，且供选择的宿主细胞和载体种类繁多，目前已在免疫学、生化药学、微生物学和分子生物学等领域广泛应用^[10]。大肠杆菌是最常用的表面显示细菌宿主，同时也是很好的原核表达系统，各种大肠杆菌显示系统已被描述^[11]。冰核蛋白（Ice nucleation protein, INP）是广泛存在于Pseudomonas syringae等革兰氏阴性菌的外膜蛋白，研究发现，INP全序列蛋白或单独的N-端结构域都可以作为锚定序列与外源蛋白序列连接^[12]，因而，可以利用冰核蛋白（INP）的表达系统作为表面展示大型复杂蛋白质的系统^[13]。细菌表面展示技术可以将分子量过大或易被降解等性质的蛋白暴露于细菌表面，已被广泛用于对外源蛋白表达效果的优化以及用于生物膜的实验。

1.3 INP-AidH蛋白

1.3.1 AidH蛋白的结构

N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）是革兰氏阴性菌QS中最具特征的细胞-细胞通讯信号^[14]，降解AHLs可有效抑制细菌群感效益，治疗感染的功效。目前，国内外已在多种细菌中发现不同AHL降解酶，根据酶的催化机制分为AHL内脂酶、AHL酰化酶和AHL氧化酶，在这些酶中，alpha;-内酯酶是近年来研究的热点。AidH，是一种来自Ochrobactrum sp.的alpha;/beta;水解酶，是一种新型的N-乙酰高丝氨酸内脂酶，具有水解酰基高丝氨酸内酯内酯环酯键的作用，在破坏群体感应效益、预防和治疗感染方面具有很大的前景。

AidH与现有的AHL酶同源性很低，，与之前发现的AHL酶不同，AidH是一种非金属依赖的酶，它不包含保守的HXHXDH金属结合基序，即Zn² 对AidH的活性是非必需的。据Gao A等的报道^[15]，AIDH的总体结构为两域结构，由一个典型的alpha;/beta;水解酶折叠核心域组成，该核心域由一个帽域覆盖，其活性位点是保守的丝氨酸蛋白酶型催化三联体：Ser102、His248和Glu219。在AIDH中，alpha;/beta;水解酶折叠超家族的经典催化三元体位于核心和帽域之间的表面，整个活动站点被帽域覆盖。

图1.1 AidH的三维结构 （来自PDB数据库和Gao A等的文章）

1.3.2 INP-AidH蛋白的功能

在Mei G Y的报道中^[16]，通过高效液相色谱和质谱分析表明，AidH是一种AHL内酯酶，能水解AHL的内酯环，产生酰基高丝氨酸，从而使AHL丧失作为信号分子的能力。在Wang 的报道中^[17]，AHL内酯酶对所有10个AHL信号分子均表现出较强的催化活性，尤其是C6-HSL活性最高。在最新的研究中，AidH，alpha;/beta;水解酶这一大类是具有不同催化功能的结构相关酶，对AHL有很强的水解活，然而，这些酶既不具有序列相似性，也不作用于相似的底物，即AidH对AHL型分子没有底物特异性。通过检测AidH对外源N-乙酰高丝氨酸内脂C6-HSL的降解能力以及降解效率^[18]，可以用以参照AidH对群体感应信号分子的降解能力，从而可以作为其抑菌、抑制生物膜能力的一种指标。同时，由于不包含保守的HXHXDH金属结合基序，AidH行使功能时不必需Zn² ，但在研究^[15]中发现，Mn² 对于AidH的活性具有正效益。可以发现AidH在降解群感信号分子，抑制由细菌群感效应带来的诸如生物膜的形成、致病菌的致病力、运动菌的运动性等方面起到很好的效果^[7]。

c

AidH

1.3.3 INP-AidH蛋白与固定化

想比于以HIS、GST^[19]等标签或磁蛋白MagR^[20]做为群感信号分子淬灭酶纯化和固定化的标签蛋白，以INP为载体蛋白的细菌表面展示系统在提取和固定化方面的操作较为简便，在表面展示中也有着非常广泛的应用^[21]。将AidH的N端和INP的C端连接构成细菌表面展示载体，转化入E.coli BL21 (DE3) 经诱导表达后的到INP-AidH重组蛋白，既增加了AidH在细菌快速生长过程中表达时折叠的正确性，又可以有效防止内源蛋白酶对AidH的降解。成功重组后的INP-AidH存在于细菌细胞膜上，INP嵌于细胞膜中，AidH表露于细胞膜外，此举相当于在AidH的N端插入一个疏水标签，给予固定化AidH蛋白一个新思路。细胞膜色谱 cell membrane chromatography (CMC)：将细胞膜结合到硅胶表面^[22]，制成细胞膜固定相（cell membrane stationary phase, CMSP）^[23]，是一种新的受体药理学实验研究方法，并广泛应用于药物受体相互作用特性与规律研究。INP-AidH重组蛋白由于INP的存在，将整个重组蛋白锚定于细胞膜中，在高压破碎细胞后得到上含有INP-AidH重组蛋白的细胞膜碎片，通过细胞膜色谱法将细胞膜碎片固定到硅胶表面，即可将INP-AidH蛋白固定于硅胶表面，获得具有抑菌效果的材料，用作其它用途。

1.4 本研究目的、内容及意义

近年来，植入材料以及导管的使用日益广泛，但是作为植入人体的材料诸如钛合金等以及长时间使用的导管等，容易受到细菌的感染。随着细菌的繁殖以及群感信号的分泌，当菌群密度以及群感信号分子达到一定程度时，信号分子会达到特定基因的操纵部位，引起特定的基因进行转录，造成诸如细菌运动、毒力尤其是生物膜形成的现象，当细菌生物膜形成时，细菌群体会在植入材料或导管表现形成一层相互接连的膜性物质，阻止抗生素或酶的作用，导致细菌感染难以阻止，从而对植入材料或导管带来极大的损失，也会对使用对象造成潜在的威胁。本研究研究目的在于利用现有的两种质粒通过连接构建新的重组质粒，从而获得具有纯度较高且具有良好降解群体感应效应分子活性的重组蛋白，并且通过细胞膜色谱的方法将重组蛋白固定在硅胶载体，以期获得具有抑制生物膜效果的载体颗粒。

本研究内容包括以群感信号淬灭酶AidH作为研究对象，利用INP的N-端结构域将AidH蛋白锚定于细菌细胞膜，经提纯后获得INP-AidH，即相当于对AidH蛋白连接上一个疏水性细胞膜碎片标签，利用缺陷型CV026为指示菌，以C6-HSL作为外源群感信号分子，对重组蛋白INP-AidH进行活性测试，探讨INP-AidH在降解群感信号分子方面的效果；利用铜绿假单胞菌 PA01作为生物膜生成菌，在24孔板中探讨重组蛋白INP-AidH在抑制革兰氏阴性菌生物膜形成中的效果；以INP-AidH上的疏水细胞膜碎片作为标签，通过非疏水相互作用将INP-AidH吸附于硅胶颗粒表面，探讨INP-AidH固定化的效果，并将固定化后的颗粒进行群感信号降解能力的测试，以期获得具有较好活性的固定化INP-AidH硅胶颗粒。

本研究意义在于利用群体感应灭酶在底物结合方面表现出的非专一性，例如本研究中针对革兰氏阴性菌群感信号分子酰基高丝氨酸内酯类的降解而提供抑制生物膜形成的思路，根据其针对不同类型的细菌都能产生很好生物膜抑制效果，为防止细菌侵染提供了一条可靠的途径。利用非疏水相互作用将重组蛋白INP-AidH吸附于硅胶颗粒表面，简便了固定化蛋白的操作，为部分植入材料以及以硅胶为原材料的导管提供了抗细菌感染以及抑菌的策略。

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