1．目的及意义

1.1研究背景

胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是细胞分泌到胞外的具有膜结构的亚细胞结构的统称，直径可以从30、40nm到8、9mm不等。本研究主要专注于直径约50-150nm的囊泡，也被称为外泌体。胞外囊泡中含有蛋白质、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA)、脂质等多种生物活性物质，这些物质或被包裹在囊泡中，或位于囊泡的膜上，使得胞外囊泡可以参与细胞间信号通讯、炎症反应、细胞凋亡和自噬等多个过程。胞外囊泡由于其低免疫原性、低毒性、高生物相容性和携带能力，在肿瘤治疗和免疫调节等方面有很大的发展潜力，有可能作为药物的天然载体。特定细胞分泌的胞外囊泡所携带的生物活性物质含量不同，有些还带有特异性标记分子，故有望成为癌症辅助诊断及预后判断的新分子标记物。

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。研究表明，miRNA能通过促进mRNA降解或抑制翻译来调控靶基因，并且能调控细胞生长、凋亡和分化等多种细胞进程。此外，不同的癌症类型的miRNA表达图谱，一些miRNA被认为在肿瘤发展或抑制中发挥一定作用。据研究，miRNA图谱与几种白血病以及肺癌、乳腺癌和胰腺癌的临床结果相关。这些数据表明，miRNA参与致癌作用并且与预后相关。

课题组之前的实验发现，多种癌症细胞分泌的胞外囊泡中miR-451a 的含量要远高于胞内的含量。也有许多研究发现miR-451a在前列腺癌、肺癌、宫颈癌、结直肠癌等多种癌细胞中有差异性表达，并对其增殖、迁移、迁徙和凋亡能力有一定的影响。

1.2研究目的及意义

胞外囊泡所携带的“货物”具有很大的异质性，不同细胞类型甚至同一细胞的不同状态，分泌的胞外囊泡都有所不同。而反过来看，不同类型的胞外囊泡或许也能一定程度地反映母细胞的状态。如果我们对miR-451a的功能进行进一步的探究，就有可能建立miR-451a表达量与癌症细胞之间的联系，那么miR-451a就有可能成为癌症诊断的新型分子标记物。我们已经发现，多种癌症细胞分泌的胞外囊泡中miR-451a 的含量要远高于胞内的含量，那么miR-451a一定是有某些功能的。囊泡将其运出胞外，可以猜想，miR-451a有可能对癌细胞的生存有害，故要排除其可能带来的危害；而另一种猜想即miR-451a对肿瘤细胞的迁徙和迁移相关，排出miR-451a是为了癌细胞的扩散等过程。对miR-451a的功能以及选择性运输机制的探究不仅有助于了解其在癌症发生中的作用，更为其作为癌症治疗、诊断和预后的分子标记物奠定了基础。
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2. 研究的基本内容与方案

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2.1 基本内容

首先在正常胚肺成纤维细胞IMR-90中进行过表达miR-451a，然后通过MTT和迁移等多种生物学实验，探究miR-451a在肺癌发生等过程中发挥的作用。之后在经PMA诱导的单核巨噬细胞THP-1中过表达miR-451a，用qPCR的方式检测miR-451a靶标MIF、M1和M2型巨噬细胞特异性标记NOS2和ARG1这三个基因的表达量，来推测miR-451a对巨噬细胞分化的影响。若NOS2和ARG1两种基因表达有差异，则使用相关试剂盒分别检测细胞裂解液中Nitrites（表征iNOS的活性）和Urea（表征Arginase活性）的水平变化。

第二步以正常胚肺成纤维细胞IMR-90和肺癌细胞A549来源的胞外囊泡为材料，处理正常细胞，进行和之前同样的检测，即通过MTT、迁移、qPCR和WesternBlot等多种生物学实验，探究miR-451a在肺癌发生等过程中发挥的作用；以转染的siRNA的方法下调A549中与miRNAs选择性运输相关的蛋白，以筛选得到与miR-451a选择性运输相关的蛋白，并对其具体作用机制进行进一步探究。

2.2研究目标

已有研究表明miR-451a在多种肿瘤细胞的发生和迁移中发挥了一定的作用，并且之前的研究发现癌细胞分泌的细胞外囊泡中miR-451a的表达量要远高于胞内。本研究通过直接在细胞中过表达miR-451a和用细胞囊泡处理正常的非癌症细胞，并通过MTT、迁移、qPCR和Western Blot等实验，对miR-451a的多种功能及其运输机制进行探究。