1. 研究目的与意义（文献综述）

国内外研究现状分析：帕金森病是一种常见于中老年人群的神经系统变性疾病。该疾病对运动系统，神经系统等造成损伤，可引发脑部病变，临床症状表现为静止性震颤，肌肉僵直，步态和姿势障碍等。pd 的最突出的病理特征为多巴胺能神经元的死亡和神经元中被称为“路易体”的蛋白质内含物的出现。作为第二常见的神经退行性疾病，pd的根本原因仍然未知。

已知，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（mptp）已广泛作为pd的病因学的研究模型，而mptp的神经毒性作用主要归功于其代谢产物mpp 。目前的研究包括急性，亚慢性和慢性三种模型。在急性和亚急性模型中，多巴胺能神经元表现为快速死亡，而且神经元中没有发现包涵体。而在慢性模型中，神经元细胞损伤死亡速度较慢且在其中形成了包涵体，因此更适合模拟pd的发病机理。除此之外，更为深入的研究表明，细胞的自噬作用在pd的发病过程中起到了重要的作用。在细胞内的降解系统中，细胞质成分通过自噬体的双膜囊泡被递送至溶酶体。脑特异性自噬缺陷的小鼠表现出神经元细胞的死亡同时也伴随着蛋白质集体凝聚等现象，显示出神经退行性病症的症状。此类研究也都证实了自噬异常导致神经退行性疾病（包括pd）的可能性。同时，多个研究组曾发现：mpp 处理的细胞模型中出现了自噬体数量增加等现象。然而他们所提出的解释这个现象的原因却不同。其中一些解释为自噬体合成增强，而另一些解释为自噬体降解减少。这种差异也表明mpp 对自噬过程的影响取决于处理条件或者是细胞类型。

本课题的目标：探索mpp 对细胞的损伤机制来研究pd的发病机制，mpp 是mptp的活性代谢产物，能产生对中脑黑质多巴胺能神经元的选择性破坏作用，二十多年来广泛作为诱导实验性pd实验模型的有效药物。pd的发生是遗传和环境因素综合作用的结果，发病机制涉及氧化应激、线粒体功能失调、蛋白质错误折叠和聚集、蛋白酶体功能紊乱、兴奋性毒性等多因素，至今pd的发病机制还不明确。首先用cck8法初步探索mpp 损伤的细胞的机制。然后，运用流式细胞仪探索对细胞损伤的机制，通过检测细胞凋亡，线粒体跨膜电位和细胞活性氧物质等变化探讨其损伤作用机制。

2. 研究的基本内容与方案

基本内容：本实验的主要内容为探索MPP 对细胞的损伤机制来研究PD的发病机制。国内外的研究已经发现，细胞对于不同浓度的MPP 的敏感性显著不同。所以介于PD的缓慢发病机制，低浓度的MPP 处理的细胞模型可能对于PD的研究贡献更大。因此，实验首先研究了低浓度MPP 处理的细胞与急性高浓度MPP 处理的细胞活性的区别来验证低浓度MPP 的效用。具体实验操作为：将细胞暴露于预定浓度的MPP 达24小时或48小时，之后使用cck8法来检测细胞活性。为了进一步阐释两种模型的毒性差异，将各种密度的细胞（分为 3*10⁴cells/cm²，6*10⁴cells/cm²，9*10⁴cells/cm²三个密度梯度来进行研究。）分别用低浓度MPP （48小时）和高浓度MPP （24小时）进行处理和检测细胞活性。除此之外本实验涉及其余四个实验操作。一，将细胞用低浓度的（0.1-200微摩尔）的MPP 处理48h并测量细胞活力。二，将细胞分别用10和200微摩尔的MPP 处理，并且在多个时间节点（6,12,24,48小时）使用cck8法测量细胞活力。三，将细胞用10微摩尔的MPP 处理并在多个时间节点（2,4,6,8天）测量细胞活力。四，将细胞分别用10和200微摩尔处理48小时，并且测定细胞内α-synuclein蛋白的聚集情况。
细胞活性检测的主要方法及原理：细胞活性检测主要用到cck8等方法。其原理为CCK-8法中的CCK-8试剂含有WST-8，其在电子载体的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄甲臢物，且生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，便可测出待测细胞样

3. 研究计划与安排

第1－2周：查阅相关文献资料，明确研究内容，拟定试验方法和条件。确定方案，完成开题报告。

第3－11周：完成细胞实验检测mpp 对细胞的损伤机制。

第12周：实验现象分析及实验数据处理。

4. 参考文献（12篇以上）

1.the €lysosome: from waste bag to potential therapeutic target

2. chronic systemic pesticide exposure reproduces features of parkinson’s disease

3. kinetics of nigral degeneration in a chronic model of mptp-treated mice