一大批环境和临床不明菌的16S核糖体DNA序列分析

MICHEL DRANCOURT,¹ CLAUDE BOLLET,¹

ANTOINE CARLIOZ,¹ ROLLAND MARTELIN,²

JEAN-PIERRE GAYRAL,² AND DIDIER RAOULT¹*

马赛蒂蒙大学医院中心微生物实验室¹

法国马西-莱托伊勒bioMe rieux开发区²

摘要：一些细菌很难用参比实验室外常用的表型鉴定方案进行鉴定。基于16S核糖体DNA（rDNA）的细菌鉴定在表型鉴定方法失败时可能提供一种有用的替代方法。然而，到目前为止，16S rDNA序列分析在常规的不可鉴定分离物鉴定中的作用还没有借助大量的分离物评估。在这项研究中，我们评估了16S rDNA测序的实用性，以此作为鉴定从环境、兽医和临床来源获得的177个分离物的一种方式。159株（89.8%）GenBank中至少有一个序列的相似度大于97%，139株（78.5%）GenBank中至少有一个序列的相似度大于99%。这些相似性评分值分别被用于在属和种水平上定义标识。对按物种的水平上鉴定的菌株，由于76株（58.7%）的生化剖面测定不准确、16株（11.6%）的革兰氏染色不准确、5株（3.6%）的氧化酶和过氧化氢酶活性测定不准确和2株的生长要求测定（1.5%）不准确，常规鉴定因生化谱测定没有产生准确的结果。经16S rDNA序列分析，仍有18个分离株（10.2%）无法鉴定，但可能是新种的原型分离株。这些菌株主要来源于环境（P 5 0.07）。16S rDNA方法未能将肠杆菌和泛肠杆菌分离物鉴定到物种水平（P 5 0.04；比值比50.32[95%可信区间，0.10-1.14]）。在其他地方，16S rDNA测序的有用性因数据库中存在大于1%的未确定位置的16S rDNA序列而受到损害。与表型鉴定不同，16S rDNA测序可以通过性状表达的变异性来修改，甚至为实验室内和实验室间可重复的稀有菌株提供了明确的数据。准确的16S rDNA新序列的增加和某些类群分子鉴定的替代基因的开发，将进一步提高细菌分子鉴定的实用性。

正文

准确鉴定细菌是临床微生物实验室的一项重要工作。对于生长缓慢和挑剔的生物体，传统的表型鉴定是困难和耗时的，当使用表型方法鉴定细菌时，测试结果的解释可能涉及大量的主观判断（20）。属于同一物种的菌株之间的表型变异也导致一些菌株呈现出非典型特征，以供候选鉴定。参比实验室，包括美国疾病控制和预防中心以及法国巴斯德研究所和BioMe rieux实验室，从不同地理来源的环境、兽医和临床标本中收集未经鉴定的微生物，并开发出大量流程图用于准确表型鉴定的图表。然而，在应用了所有可用的表型试验后，仍有许多菌株无法识别。在这些情况下，基于16S核糖体DNA（rDNA）的分子鉴定可以实现鉴定，其原因包括其在细菌（30）中的普遍分布和物种特异性可变区的存在。这种分子方法已广泛用于细菌系统发育（32），导致建立大型公共领域数据库（13，27）及其在细菌鉴定中的应用，包括环境和临床未培养微生物（17，22）、独特或不寻常分离物（7）的鉴定，表型鉴定分离物的收集（23，24）。在这种情况下，基于16S rDNA的鉴定比计算机辅助细胞壁脂肪酸分析和计算机辅助生化分析的72株需氧革兰氏阴性杆菌（23株）和52株棒状杆菌（24株）的鉴定结果要好。然而，它的可靠性和性能从来没有用一组无法识别的分离物来评估过。

我们现在已经评估了16S rDNA序列分析作为一种工具，通过应用该分子工具对177个无法识别的菌株的BioMerieux集合进行分子鉴定。

材料和方法

细菌分离及常规鉴定方法。

作为其微生物学诊断承诺的一部分，BioMerieux为微生物学家提供了一个机会，让他们在使用其商业鉴定条进行检测时，提交未经鉴定的分离物进行研究。在对生物体进行纯度检测之后，对它们进行广泛的表型研究，包括呼吸类型和生长温度的研究、Gram染色后的细胞形态、孢子形成能力、氧化酶和过氧化氢酶活性和生化图谱。用ApICRONE检测革兰阳性杆菌，用ApistRp检测过氧化氢酶阴性革兰氏阳性球菌，用Apistah和ID32 STAPH检测过氧化氢酶阳性革兰氏阳性球菌，用API20E检测氧化酶阴性革兰阴性杆菌，用APIN检测革兰氏阳性革兰阴性杆菌，并用API20E和API50CH对芽孢杆菌进行了检测。每一个可疑的测试都重复两次。一旦这些试验完成，就可以参照已发表的细菌种类描述（15，31）进行表型鉴定。平均每年接收300株菌株进行分析，其中约有20%的菌株仍然未被确认。在这项研究中，3年多的时间我们收集了177个无法辨认的细菌分离物。这些分离物来自环境源（177份中的 79份；44.6%）、兽医临床样本（177份中的17份；9.7%）和医疗临床样本（177份中的81份；45.7%）。在分子分析允许鉴定（见下文）后表型数据被重新评估，以确定导致常规鉴定失败的原因。这些缺陷被分类为生长需求确定失败、形态学和Gram染色测定失败、氧化酶和过氧化氢酶活性测定失败和生化测定失败。

16S rDNA测序。

每个分离物被镀在胰蛋白酶大豆琼脂、5%绵羊血琼脂或巧克力琼脂（BioMerieux）上。细菌通过煮沸15分钟（革兰氏阴性杆菌）或在20%Chelex悬浮液（革兰氏阳性球菌）中煮沸20分钟（21）溶解。或者，将革兰氏阳性杆菌在37°C的Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，0.1 mNaCl，pH 8.0）中培养1小时，接着在55°C的25 mg蛋白酶K/ml和10%十二烷基硫酸钠溶液中培养1小时，然后将200 ml的4 mM胍硫氰酸盐添加到每个试管中，在室温下放置一小时，其后在100°C下用50毫升0.5 M NaOH加热10分钟。用PCR技术和通用16S rDNA引物fD1和rp2（30）对提取的DNA进行扩增（比利时瑟朗Eurogentec）。扩增产物的扩增和测序如前所述（6）。16S rDNA序列与GenBank、EMBL和DJB数据库中可用的序列通过国家生物技术中心信息服务器（1）使用gapped BLASTN 2.0.5程序进行比较。使用BLOSUM 62矩阵进行比较，其包括缺省参数，包括间隙存在成本为11，每个残余物成本为1，lambda;比为0.85。每一个序列都与前10个数据库序列进行比对，得到序列相似度最高的分数，并对数据库序列的质量进行评估。只有含有1%未确定位置的16S rDNA数据库序列被保留用于分析；未知位置（N）、嘌呤位置（R）和嘧啶位置（Y）被认为是未确定的碱基。如果数据库序列显示0.1%的不确定位置，则确定该类型菌株的16S rDNA基因序列。

鉴定标准。

物种级鉴定被定义为16S rDNA序列与GenBank中原型菌株序列的相似性为99%，属级鉴定被定义为16S rDNA序列与GenBank中原型菌株序列的相似性为97%。未能识别被定义为与分析时（1999年5月）存放在GenBank的16S rDNA序列相似性得分低于97%。

未鉴定菌株的系统发育分析。

对未经16S rDNA序列分析鉴定的菌株，从16S rDNA序列比较中推断其分类关系。序列从GenBank数据库获得，并使用BISANCE软件包（5）中的多序列比对程序ClustalW（26）进行比对。通过使用PHYLIP软件包（8，9）3.4版中的程序，从这种比对推断出系统发育关系。在Jukes、Cantor（11）和Kimura（12）的假设下，使用DNADIST生成距离矩阵。利用邻接法从这些基质中得到系统发育树。分离物被分为两个菌株的分类类群，形成未鉴定分离物的分类框架。

差异分析。

如果16S rDNA序列在GenBank（如上所述）中含有0.1%的不确定位置，导致相似性得分较低，则按顺序测定从巴斯德研究所（法国巴黎巴斯德研究所）和美国类型培养物研究所（弗吉尼亚州马纳萨斯）收集的16S rDNA序列完善分子分析。

统计数字。

通过Epinifo第6版（疾病控制和预防中心）进行了鉴定比率的比较。

结果

16S rDNA序列分析及细菌鉴定。在研究中的所有分离株中，获得了一个几乎完整的16S rDNA序列，其未确定位置少于1%；因此，有177个查询序列可供比较（表1）。对于棒状杆菌属的三个分离物（1.7%）和一个未知物种，在最初的16S rDNA扩增尝试失败后，必须重复DNA提取。对于两个分离株（1.1%），在第一次分析显示可能存在混合序列后，必须进行两次16S rDNA测序。基于16S rDNA的分析将分离株分为三类（表1和图1）。177个分离株中，共有139个（78.5%）具有16S rDNA序列，与先前鉴定的细菌物种的相似性为99%。177个（89.8%）中有159个具有16S rDNA序列，与属成员的相似性达97%。在这159个分离株中，肠杆菌和pantoa的16S rDNA序列与GenBank序列的相似性为99%，显著低于其他属的分离株（P 5 0.04；比值比50.32[95%可信区间，0.10～1.14][Fischer精确检验]）。177个分离株中有18个（10.2%）具有16S rDNA序列，与GenBank中最接近的序列有97%的相似性。从临床或环境来源获得的菌株在达到99S rDNA相似水平方面没有显著差异。然而，18个分离株中有12个与其他GenBank序列相似，97%来自环境源（Mantel-Haenszel检验P＜0.07）。共有41个与新种和新属相对应的16S rDNA原始序列被存入公共数据库（表1）。

未知分离物的分类关系。

16S rDNA分析表明，18株未鉴定菌株中有6株属于低G1C含量革兰氏阳性菌，4株属于高G1C含量革兰氏阳性菌，6株属于gamma;亚群蛋白菌，2株属于拟杆菌噬细胞门。通过邻接分析推断的这些分离株的系统发育关系如图2所示。

常规识别故障分析。

图1给出了适当的常规识别中的故障。在分析的16株芽孢杆菌中，基于16S rDNA的鉴定证实了3株菌株的常规鉴定；常规鉴定不准确的原因是7株菌株的革兰氏不匹配、5株菌株的生化图谱不匹配和1株菌株的生长需要测定不匹配。在使用常规方法时未能准确地鉴定大肠杆菌分离物是八个九个菌株中不匹配的生化分布测定结果和九个菌株中的一个不准确的氧化酶活性测定的结果。由于对所有9株葡萄球菌的生化剖面测定不准确，导致常规鉴定葡萄球菌失败。

讨论

在本研究中，不适当的DNA提取阻止了2%菌株的16S rDNA鉴定。各种提取方法已经被发表（23），但没有一种最佳方法被广泛接受。因此，需要改进可靠的方法，特别是随着自动化的出现。混合培养导致基于16S rDNA的鉴定失败率为1%，这可能是因为在继代培养中选择了错误的菌落，或者是因为在扩增过程中不小心包含了多个细菌物种，导致16S rDNA数据不明确。因此，在基于16S rDNA的鉴定之前，应注意获得纯培养物。或者，混合16S rDNA序列可以在测序之前通过变性梯度凝胶电泳（18，25）分离。同样，在多个核糖体操纵子（3）中呈现不同的16S rDNA序列的细菌物种之间形成的不同的rRNA基因拷贝（29）之间形成的PCR诱导嵌合体可能导致不存在的物种的描述。应特别注意仔细检查电泳图中的双峰。最后，与蛋白质编码基因不同的是，16S rDNA没有被组织成密码子，因此在比较序列之前，无法验证每个碱基位置确定的准确性。在查询序列或数据库序列中，位置模糊度高于1（；15个位置）的百分比阻碍了对序列的解释，我们建议常规地获得模糊度小于1%的16S rDNA序列。对于某些属来说，数据库中存储的物种太少，因此特定查询序列的相似性级别不会超过97%。

当同一物种有多个16S rDNA序列可用时，在多达48%的沉积序列中，16S rDNA序列变异水平超过了序列的1%（4）。一个精确的商业16S rDNA数据库，被用于细菌的鉴定（23），避开了这个困难，但是序列的准确性可能会被有限的序列数量所抵消。在评估序列之间的相似性百分比时，如果只比较了有限的一部分基因（未显示数据），非修饰程序通常比间隔程序的得分高。在基于16S rDNA的鉴定中，是否只应将该基因的最可变区域结合在一起尚待确定。该方法已用于鉴定需氧革兰阴性杆菌（23）。在这种情况下，应该使用非apped程序。在本研究中，为了使用与查询序列完全相同的方法来获得结果，我们使用应用于整个16S rDNA序列的间隙程序来获得相似度百分比。间隙放置的自由度仍有待确定。实际上，根据我们的经验，当使用不同的程序将同一序列与同一数据库进行比较时，会得到不同的相似性结果，从而导致不同身份的分配。相似度得分取决于被分析序列的长度和查询序列中引入的用于优化相似度间隔数。不幸的是，在识别过程中没有使用这些参数的指南。基于本研究的结果，我们建议对比至少要包含1500个位置的比较，相似性搜索中包含的所有序列具有相同的长度，并且使用不带上限的程序。然而，间隙分析与非间隙分析的问题将需要更多的数据。

对于基于16S rDNA的细菌鉴定，还没有公认的计算机辅助序列相似性比较指南。使用16S

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