少突胶质细胞的直接转分化

摘要：少突胶质前体细胞（OPCs）移植是一种很有前途的治疗髓鞘疾病的潜在治疗策略。然而有学者已经证明，利用人多能干细胞产生可移植的OPCs非常困难，并且主要的OPCs并不容易获得。本文介绍通过直接转分化产生诱导OPCs（iOPCs）的过程。三种转录因子Sox10，Olig2和Zfp536的强制表达，足以将小鼠和大鼠成纤维细胞转分化为iOPC，且iOPC的形态和基因表达特征都类似于初级OPCs。更重要的是，当iOPCs产生成熟的少突胶质细胞与原代背根神经节细胞共培养时，可以包裹多个宿主轴突，并在移植到髓鞘损伤小鼠后形成髓鞘。我们提出，将直接转分化作为生成OPC的可行替代方法用于疾病建模和再生医学。

少突胶质细胞前体细胞（OPCs）是分布在整个中枢神经系统中的常驻祖细胞。它们的主要作用是在脑发育过程中分化为少突胶质细胞和鞘髓鞘轴突，并在脑损伤后髓鞘再生。髓鞘形成是一个复杂的生物学过程，包括轴突识别和附着、膜包裹和压实以及髓鞘维持。一般认为，这些任务是由OPCs完成的，而不是成熟的少突胶质，因为动物模型中的移植研究发现，移植的OPC很容易进行髓鞘形成，而成熟的少突胶质细胞则不然。因此，科学家认为OPCs细胞群用于髓鞘形成和脱髓鞘疾病的治疗很有希望和前景。特别是影响髓鞘的遗传性疾病，如佩-梅病和易染性脑白质营养不良，将成为基于细胞疗法的理想候选者。此外，如脊髓损伤和多发性硬化等更普遍的疾病的治疗都可以从OPC移植中受益。值得注意的是，来自胎儿大脑或胚胎干（ES）细胞的OPCs已被证明能够在髓鞘疾病的啮齿动物模型中髓鞘再生髓鞘，在某些情况下具有令人印象深刻的治疗效果。但是，原代人体组织受到限制，胚胎细胞则分化缓慢。因此，我们试图确定OPCs是否可以通过直接转分化，从如成纤维细胞等易于获得的体细胞谱系产生。

在此之前，我们鉴定了转录因子组合，它能快速有效地将小鼠成纤维细胞直接转化为全功能神经元细胞，我们称之为诱导神经元细胞。我们和其他人进一步证明了人成纤维细胞产生iN细胞; 我们的标准iN细胞因子与其他亚型特异性因子的组合允许产生神经元亚型，如多巴胺和运动神经元; 最近，从小鼠成纤维细胞诱导出三能神经前体细胞。在这里，我们显示转录因子介导的重编程也可以应用于生成OPC样细胞。我们发现三种因子Sox10，Olig2和Zfp536的强制表达将啮齿动物成纤维细胞转化为表达适当OPC标记的iOPC，在OPC培养基条件下增殖，在移植到髓鞘发育不良的寒颤小鼠脑中后分化成体外少突胶质细胞和髓鞘宿主轴突。

结果

OPC重编程因子屏幕

为了鉴定候选OPC重编程因子，我们使用来自详细全基因组表达研究的数据，并过滤了与其他神经谱系相比在少突神经胶质细胞中具有更高表达的转录因子的基因。我们选择了10个参与OPC规范不同阶段并在突变时引起严重发育性少突胶质相关缺陷的因素，包括ascl1、gm98、myt1、nkx2.1、nkx6.2、olig1、olig2、sox10和zfp536。我们使用了一个特征明确的蛋白脂质蛋白（plp）：egfp转基因小鼠株，在opcs和成熟少突胶质细胞中表达egfp，作为少突胶质细胞存在的报告者。小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养物是从E14.5胚胎肢体中分离出来的，这是一种组织来源，我们之前已经证明，它产生了一个成纤维细胞群，基本上没有表达神经元、神经祖细胞和神经嵴干细胞标记的细胞（参考文献14和图1a）。用含有候选基因的10种不同慢病毒池转导plp:：egfp-mefs，并在已知支持opc增殖的培养基中培养。基于荧光显微镜或流式细胞仪分析，未感染或感染对照病毒的培养物中未检测到EGFP表达。相比之下，在引入10个因子的7天后，培养物中出现少量的egfp 细胞。再过14天，用O4抗体对细胞进行固定和免疫荧光分析，这种抗体可以特异性标记少突胶质细胞和晚期OPC。这揭示了PLP:：EGFP /O4 细胞的存在，具有典型的少突胶质细胞的形态（图1b和补充图1）。因此，10个候选因子的一些组合在部分感染细胞中诱导少突胶质细胞特性。为了确定向少突胶质细胞系重新编程所需的最低转录因子，我们首先确定是否有任何单个因子足以产生EGFP 细胞。在这10个候选细胞中，只有SOx10可以激活plp:：egfp报告器，尽管只有一小部分受感染细胞（图1b）。然后，我们结合剩下的9个候选因素测试了SOx10的重新编程活性。四个因素（nkx2.2、nkx6.1、olig2和zfp536）显著增加了sox10产生egfp 细胞的活性（图1c）。在系统消除的综合过程中，我们确定SOx10、olig2和zfp536的组合是能够以最高效率诱导egfp表达的最小因子池（图1d，e）。我们使用荧光活化细胞分选（facs）独立重复这些实验，在一周后测定egfp 细胞的分数，并观察到类似的结果（补充图2）。因此，我们得出结论：SOx10、olig2和zfp536三个因子的强制表达是我们试验的从mefs诱导plp:：egfp 细胞的最佳组合。

大鼠成纤维细胞诱导OPC的产生

鉴于原代大鼠OPC的广泛表征和完善的培养条件，我们随后测试了Sox10，Olig2和Zfp536的组合是否可以将大鼠成纤维细胞转化为OPC样细胞（图2a）。我们观察到大的、增殖的细胞簇，具有双极的、类似于OPC的形态（图2b），感染后14天可以用O4抗体标记（图2c；参考文献26和28）。这些O4 细胞对血小板衍生生长因子（pdgf，一种已知的opc有丝分裂原）的反应而增殖，如edu掺入所揭示的（补充图3）。我们还发现一些gfap 星形细胞，但感染后20天没有tuj1或map2阳性神经元（补充图4）。在确认对照大鼠成纤维细胞中不存在O4 细胞后（补充图5），我们使用已建立的免疫淘选方法纯化大鼠O4 细胞，并在本研究的其余部分中将它们用于进一步的表征。当置于含有PDGF的培养基中时，免疫泛蛋白O4 细胞表现出典型的OPC形态，并且对于另外三种OPC标记物NG2，A2B5和S100beta;染色阳性（图2d-g）。免疫组化O4 细胞的基因组DNA的PCR分析证实了这三个前提条件的整合（补充图6）。考虑到成纤维细胞来源的O4 细胞在PDGF的作用下增殖，表现出典型的形态和表达OPC的关键标记物，我们称这些细胞为“诱导的OPC（IOPC）”。观察到的GFAP 细胞可以指示星形胶质细胞限制性祖细胞的产生或双能的，胶质细胞限制的祖细胞的自发分化。由于神经元的缺失可能建议不允许不受干扰的神经元质子细胞。

接下来，我们描述了重编程动力学和效率。由于成纤维细胞和iOPC都是增殖性的（图2h），因此无法确定真正的细胞转化效率。相反，我们评估了眼内压的产生，定义为感染后第20天O4免疫细胞数与感染成纤维细胞数的比率（见方法）。接种和感染2.4times;105成纤维细胞/cm2后，约25.9plusmn;4.9%的成纤维细胞均表达这三个因子，诱导后20天平均可恢复6.8plusmn;1.7times;104 O4 细胞/cm2，此时重编程率约为106.7%（图2i）。IOPC纯度（定义为第20天O4免疫细胞与采集细胞总数之比）平均为15.6plusmn;3.3%（图2j）。我们注意到，产量是一个依赖于重编程效率、细胞死亡和增殖的参数，因此真正的重编程效率几乎肯定较低。实际上，当细胞增殖的影响可能较小时，O4 细胞的产量在较早的时间点显着降低（图2h）。此外，功能性iOPC的产量甚至更低，因为O4 细胞的分化效率是原代新生儿OPC的分化效率的约25％（见下文）

诱导OPC的整体转录重构

接下来，我们通过微阵列分析比较了大鼠眼压、成纤维细胞、原代OPC及其分化后代的基因表达模式。一个热图描绘了所有探针组，这些探针组在任何样本之间至少有2倍的差异表达，显示成纤维细胞特征转录程序被全局重编程为少突胶质谱系（图3a）。与成纤维细胞相比，IOPC中上调的基因在与少突胶质细胞生物学相关的GO术语中显著丰富（所示均为P值lt;10-9的GO术语）。相反，在眼内压中，具有显著丰富的涉及中胚层细胞功能的Go项的成纤维细胞特征基因整体下调（图3a）。手动检查基因簇表明，与成纤维细胞相比，已知参与祖细胞自我更新或少突神经胶质细胞命运测定的许多基因，如Sox2，Sox6和Nkx2.2，在iOPC和OPCs中被强烈上调（图3a）。成纤维细胞特异性基因Col1a1，Col5a1和Thy1的转录水平显着下调（图3a）。我们通过定量RT-PCR证实了这些基因的表达变化（图3c，补充表1）。与这些结果一致，无监督的层次聚类分析和Pearson对所有差异表达基因表达值的相关性分析表明，iOPCs的转录谱与初级OPCs（r2 = 0.42）比成纤维细胞（r2 = 0.15）更相似（图3b）。定量RT PCR分析表明，与初级OPCs相比，与OPCs分化相关的一些基因（如Cdkn1c，Mbp，Mog和Plp1a）的mRNA水平在初级OPCs中高于不同程度，但低于成熟少突胶质细胞（参见图2）。然而，这些分化相关基因的高转录水平似乎不足以产生可检测的蛋白质，因为在基于免疫荧光的IOPC培养中没有发现MBP、PLP、CNP或MOG阳性细胞。根据定量RT-PCR结果，Pearsons的相关分析显示iOPC与早期分化OPCs的相似性高于未分化的OPCs（图3b）。对图3a中的总热图的检查还表明诱导了在少突神经胶质细胞样品中未表达的iOPC中的一组基因。事实上，有31个代表24个基因的探针组被发现在眼内压中上调，但在其他样本中没有上调（补充表2）。这组基因不能被赋予连贯功能（补充表3）。

诱导OPC向髓鞘少突胶质细胞分化

为了评估iOPCs的功能特性，我们首先评估了体外iOPCs的分化潜能。在停止PDGF后，免疫泛蛋白O4 细胞停止分裂并分化成表达MBP和CNPase的细胞，并且表现出成熟的少突胶质细胞形态（图4a和b）。分化3周后，11.6plusmn;2.5%的细胞为MBP 。考虑到OPC在体外可以产生星形胶质细胞，我们还评估了分化的IOPC培养中的gfp和nestin表达。容易观察到GFAP （27.6plusmn;1.7％）和Nestin （29.0plusmn;5.0％）星形胶质细胞，但是，没有Tuj1或Map2阳性神经细胞存在（图4c，d和补充图4）。然后，我们利用背根神经节神经元（DRGS）的共培养系统评估了IOPC体外的髓鞘生成潜能。纯化的DRG可以在O4免疫组化眼压前延伸轴突的致密层。共培养9天后，IOPC产生MBP 细胞，具有复杂的少突细胞形态，靠近神经丝 轴突（图4e）。许多MBP 细胞延伸出与周围轴突紧密排列的多个独特的膜延伸（图4e盒装细胞）。在存在DRG的情况下，O4 iOPC向MBP 少突胶质细胞的分化效率略微增加至15.5plusmn;1.9％（图4f）。这种分化效率约为大鼠原代新生儿OPC的25%（B.Z.，B.B.，自己的观察）。为了研究体内iOPC对髓鞘宿主轴突的能力，我们将O4免疫泛蛋白大鼠iOPCs移植到摇摆小鼠脑中。这些小鼠缺乏大量的MBP基因，并且整个中枢神经系统都有髓鞘发育不良的轴突。因此，该移植模型允许明确检测移植物源性少突胶质细胞，因为任何MBP信号必须来自移植物细胞。将纯化的iOPC双侧注射到新生小鼠的胼call体和小脑中（n = 3）。为了保持初始转基因表达，将多西环素加入哺乳雌性小鼠的饮用水中3周，并在12周龄时处死移植的shiverer小鼠，并将它们的大脑冷冻切片并用MBP进行免疫染色。在3个移植脑的所有12个注射部位：小脑的皮质，胼call体和白质束中检测到形成管状结构的小的分散的MPB 细胞群（平均每个注射部位约90-100个细胞）。MBP染色后未移植的寒颤患者脑组织未见类似结构。所有MBP 细胞都分析了共表达的PLP，这是一种跨膜蛋白脂质蛋白，是存在于中枢而非周围神经系统的主要髓鞘蛋白（图5b）。MBP 细胞不表达蛋白0（p0），即外周髓鞘或外周黏附素的主要结构蛋白（图5C和补充图7）。共聚焦显微镜显示MBP 管样结构包围神经丝 轴突，显示移植IOPC对宿主轴突的少突胶质保护（图5d，e）。最后，我们在超微结构水平证实了移植的iOPC的髓鞘形成（图5f和补充图8）。这些结果表明，成纤维细胞衍生的iOPC可在体内产生髓鞘化少突胶质细胞。

讨论

本文通过强制表达三种确定的转录因子，证明了成纤维细胞可以直接转化为诱导的OPCs的原理。在对10个候选转录因子进行系统评价后，我们确定了一种最低要求的sox10、olig2和zfp536的组合，这种组合足以有力地诱导被称为iopcs的opc样细胞。这些细胞具有OPCs的典型形态，表达相关的OPC标记O4，NG2和A2B5，像OPCs一样响应PDGF信号传导，并显示朝向OPC样分布的全局转录重编程。值得注意的是，它们产生成熟的少突胶质细胞，在体内能使宿主轴突髓鞘化。这表明IOPC是一种功能性的前体细胞，可以执行与髓鞘形成有关的高度协调和复杂的细胞生物学过程，如轴突识别和附着、膜包裹和压实。我们观察到小的移植物大小，这是由于新鲜免疫细胞的短期存活率极低。因此，所有移植位点中MBP 细胞的检测都证明了iOPC的体内分化能力非常强。几个证据表明，iOPC与初级OPCs相似但不完全相同。与新生OPCs相比，成纤维细胞衍生的iOPCs分化成成熟少突胶质细胞的效率较低，并且它们的基因表达谱与初级OPCs相似但仍然不同，尽管成纤维细胞特异性转录网络程序似乎有效下调。这些转录差异可以通过几个不相互排斥的原因来解释。首先，iOPC培养物（由O4免疫反应性定义）可代表完全和部分重编程细胞的相当异质的群体，类似于诱导多能干（iPS）细胞的第一次报道中发现的。然而，尽管转录谱似乎更类似于接受分化的OPC，但分化基因的mRNA水平升高不会导致可检测的蛋白质或成熟的少突胶质细胞形态，这表明它们在功能上可能不重要。此外，我们还观察到一小部分IOPC特有的异常表达基因。这些可能是重新编程因子的直接或间接靶点，这些因子在调节其他细胞谱系（例如，在神经顶谱系中的SOx10，在运动神经元和腹侧前脑神经元中的OLIG2）中有记录的作用。未来的研究可以解决这些相当微妙的差异是否会导致可检测的功能后果。值得注意的是，我们认为所描述的iOPC极不

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 16 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[278861]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word