土壤指示生物——线虫的分子生物学监测方法的比较

A comparison of molecular methods for monitoring soil nematodes and their use as biological indicators

X.Y. Chen ^a,c,d,*, T.J. Daniell ^b, R. Neilson ^b, V. Orsquo;Flaherty ^c, B.S. Griffiths ^a

摘 要

土壤动物,尤其是土壤线虫群落可用作指标监测土壤生物多样性和生态过程。生态学家面临的问题主要是缺乏为了识别土壤动物区系的传统形态所需的专门分类知识以及繁琐的工作量。本文综述了快速分子方法,包括:DNA条码技术或测序,PCR-DGGE，PCR-TRFLP和实时PCR技术，这些可以作为监测土壤线虫群落的工具。基于以下优势:高通量;易于对比样品,和快速的数据分析,我们认为PCR-TRFLP方法能够很好地达到监测的目的。

关键词：生物多样性；土壤动物区系；线虫；形态学鉴定；分子生物学方法

1.引言

1.1线虫作为土壤指示生物

近几年，特别是自《土壤框架指令 》的起草和国家增加了对土壤监测的经费后，土壤科学家和生态学家逐渐重视起监测土壤的质量。土壤质量是指维持土壤功能的各种物理、 化学和生物的属性的综合。土壤质量指标应该响应管理实践, 整合生态系统过程，并不断构建现有的可访问的数据库。通过这类指示生物的群落数量来监测土壤的改善、维持及退化情况，从而可以在不同生态系统中表征土壤质量不同特性，力图测量三个基本功能参数: 土壤结构的发展、营养存储和生物活性。

众所周知，土壤无脊椎动物对土壤扰动和外界干扰高度敏感。例如，蚯蚓被用来指示土壤性质和土壤污染程度；线虫用于环境监测；大型无脊椎动物用于检测土壤重金属污染；弹尾目昆虫用于环境的恢复。线虫作为整体生态条件的指标是由于广泛的食性和它们能反映了生态系统的阶段性演替。此外，线虫对环境十分敏感，它们分布和活动的改变可以用来判断土壤的变化，是最丰富的土壤后生动物。土壤线虫食性多样，包括有许多独立生存,以土壤微生物(细菌和真菌)为食。在许多生态系统中，以微生物为食的线虫是最重要的真菌和细菌的消费者，他们与微生物分解者的相互作用影响了生态系统中的分解和养分循环等过程。

1.2. 常规监测的局限性

土壤动物鉴定往往需要高度专业的分类学知识，此外，鉴定需要花费大量的的时间和相应成本，所以在一个相对较短的时间内很难得出结果。这对线虫来说尤其如此，鉴定所有个体到物种水平是耗时的，因此，线虫群落特征分析，一般在种的水平以上，（比如属、科、营养类群）进行就可能出现模棱两可和不能具体而明确描述的情况。还有一种情况，就是线虫鉴定只能依赖于成体的形态特征，而它们通常只代表了线虫群落中的一小部分。

所以，尽管使用线虫作为生物指标有许多优点，但是要辨别功能还得依靠专业的研究者。可能的解决办法是要找到合适的能允许实证评估土壤动物生物的多样性的分子生物学方法。目前，像这类传统的分类方法正在减少，而逐步转向了分子方法。

1.3.识别动物的分子生物学方法

安德烈等人 (2002 年) 强调土壤动物群落检测发展的必要性和方法的一致性，认为分子技术现在广泛应用于土壤微生物学并且大大增加了我们对土壤微生物的了解。分子生物学方法为已有物种的常规评估提供了传统形态学鉴定以外的方法。分子生物学方法的应用使得土壤生物种群分析成为可能，克服了需要从复杂混合物中识别细菌和真菌的缺点，同样可以减少目前描述群落的专业分类知识的需求。新的,高通量测序技术能在很短的时间和以较低的成本生成大量的序列数据。这些分子方法最重要的应用之一是能够从复杂的群落中识别大量的物种。除了更快速高通量识别并且只需要较少的专业技能的优点外,分子生物学技术也能快速鉴别小型线虫，尤其是当前很少有人证实序列的类群，虽然需要采取单基因标记。单一线虫标本的扩增及测序的诊断区域 (即迅速演变 SSU rDNA 和LSUrDNA 编码的小型和大型的亚基rRNA的区域) 使公共DNA序列数据库得以发展，可用于线虫系统发育的比较。虽然 DNAbased 数据库以植物寄生线虫类群为主，但是对于土壤线虫中的独立生存类别的识别在不断改善。最近的出版物---陆地线虫发展史使线虫鉴定，及它们的生态功能进一步明确。

2. 分析线虫群落的分子生物学方法

Vanderknapp 等人 (1993 年) 用任意引物聚合酶链反应技术区分传统形态上难以分辨的亲缘关系相近的食细菌线虫种类 (从琼脂培养) ，并建议这项技术可以用于生态环境。然而,这将要求个别线虫的PCR扩增至少有三个不同的引物并且无法识别幼小线虫。自这早期的例子后，目前已出现了更加切实可行的解决办法。

2.1 DNA条码技术或测序

DNA条码技术以基因组上的一小段序列为基础，这段序列是特定种的特异序列，并带有一种生物的系统发育信息。这项技术应适用于所有生物的分类鉴定。

DNA 条码技术可用于未知样品的鉴定，通过与已知的参考序列的比较帮助了解未知类群的系统发育分布，使分子操作分类单元得以明确。从理论上讲，这允许来自生物个体或从环境中的 DNA 样品分离的序列能够被快速而高通量地识别；在陆地和海洋生境中的线虫、 缓步动物和其他小型底栖动物的调查也已用到DNA 条形技术。例如，Floyd 等人 (2002 年)在他们自己的农场草地生态系统研究站随机抽取166个样本，他们用PCR 扩增产物分析了其中的MOTUs74, 从而他们开发了一个简易地可以用于检测土壤线虫多样性和丰度的系统，并对其做了一些改进之后，这种方法能够适用于群落分析。

汉密尔顿等人 (2009 年) 直接从土壤样品中提取动物的 DNA，然后用聚合酶链反应与后生动物特异性引物，来测定中小型土壤动物群落的组成。这项技术已在更丰富生物群落（线虫，弹尾目昆虫、 蜱螨亚纲，缓步动物)的分类上得到应用，并为描述土壤动物区系的整体结构提供了充足的分类依据，然而线虫目前却只被分成两个主要的类别(Chromadorea 和 Enoplea)。基于MOTU分析技术，保尔等人 (2009 年) 评估了位于热带雨淋栖息地的那些分布于土壤、 凋落物和灌木丛中的线虫群落多样性。

条码技术有效性是取决于被选择的标准化基因区域的标识。到目前为止，条码已经在动物群落中通过使用细胞色素c氧化酶1 (CO1) 648 bp的区域基因被最广泛测试。很多土壤和海洋线虫的研究都18S rRNA 基因为研究载体，采用了包括CO1在内的等很多靶基因，但是最可靠的PCR扩增只有从18 s rRNA获得基因。最近，CO1基因被成功地用于查明丝虫病的线虫。18S rRNA 基因的优点是拥有大量的可用序列数据，随着科技的发展，未来可能将线虫条码用于其他动物门。

使用测序方法的下一步是应用焦磷酸测序或其他所谓的新一代测序技术。这种做法是在线虫群落分析中没有尝试过的。 Porazinska 等人于2007年提出了一个结论强烈支持454技术适用于鉴定来自各种生境中的所有线虫个体。然而，在这一点上，利用部分读取推断线虫群落内物种的相对丰度是言之过早。这种技术用于监测可能并不恰当，其真正的作用在于能够从相对较少的样本中提取大量的信息，然而生物监测的要求是从大量的样本获取相对较少的信息。

2.2 PCR-DGGE

几个研究团队已尝试利用变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 分析土壤或海洋线虫群落，估计线虫多样性。通过根据变性梯度凝胶电泳分离得到的不同频段大小相等的DNA 序列来鉴定线虫类别。

怀特等人 (2003 年) 还利用于 DGGE 分析了从一克土壤中提取的线虫群落的DNA，做了一个线虫群落的“指纹”来鉴别线虫种类,但是这种方法不可能推断出线虫的遗传多样性或任何特定分类单元的线虫相对丰度。福契等人 (2004)从更大的土壤样品 (100e200 g 土壤，比 1 g 土更有环境条件代表性)提取线虫进行分析，并将放大非靶标生物的风险降到最低，但未将分析结果与线虫形态鉴定结果相比较，未能揭示物种丰富度。

从土壤监测的角度来看，不能揭示特定类群将是DGGE的一个缺点。虽然PCR-DGGE 在荷兰土壤监测网络中被用于监测细菌生物多样性，但仅仅只是用于群落的数量。这种方法缺少对线虫群落的分类及功能评估。

2.3. PCR-TRFLP

末端限制性片段长度多态性 (TRFLP) 分析是一种具有高度重复性的方法，其中荧光标记产品在自动化 DNA 测序仪中被量化。TRFLP 分析可以利用选择限制性内切酶在预先存在的序列库中生产所需片段(定向 TRFLP)，这样，不同类群产生明显的不同限制片段 (RF) 峰。或基本上是给予没有分类的信息的指纹 随机消化 (随机 TRFLP)。类似的做法最初是用于鉴定细菌群落现供线虫鉴定。

Donn 等人 (2008) 证明 TRFL基于一个单一的、 随机选择酶就足以区分从五个栖息地 (耕地农业、 沙丘、 针叶林、 永久草场和高沼地)提取的线虫群落。赫尔曼等人 (2008 年) 也用随机 TRFLP 分析来评估原生动物和线虫的群落结构，使用组特异性 PCR 引物，显示TRFLP 程序具有区分土壤生物群落结构的潜能。吉布等人(2008) 使用 TRFLP分析了土壤螨类，并发现螨群落有一系列不同长度的DNA 片从而反映螨序列多样性 。他们使用一个随机TRFLP加上一个参考序列的数据库发现了螨虫，但目前公共数据库中十分缺乏关于土壤螨的序列，这是其中一个限制因素。另一种方法是直接TRFLP,首先获取序列信息，然后分析为了寻找一个酶结合位点而被分离的序列来提供生态学信息。

TRFLP的主要优势是能够轻松地比较不同测序器运行数据，不像DGGE那样在凝胶之间的比较相对困难。每个样品的标准大小要求尺寸十分精确，从而使跨电泳运行片段大小准确达 700 bp；如果犯微小的错误就会使大小变为100bp。自动化加载的毛细管测序器降低了运行之间的变异性和数字输出从而允许进行快速、客观的数据分析。由TRFLP得到的群落“指纹”也可以翻译成分类信息。TRFLP通过 96 或 384 孔板格式，加上电子数据输出和自动化的片段调用软件使它成为真正快速数据分析的高投入技术。但是要使这项技术达到监测目的需要大规模时间和空间研究以及统计分析能力。

2.4. Real-time PCR

实时定量聚合酶链反应检测比常规 PCR更快速、 具体，敏感，被广泛地应用于特定的经济重要物种的量化。实时聚合酶链反应能够检测出的DNA浓度低于常规PCR的八倍。例如马铃薯胞囊肿线虫,可以通过形态差异和繁殖的能力来区分，同时检测和量化马铃薯胞囊肿线虫种类的PCR方法也已经开发出来。实时PCR方法更快速、可靠并且容易解释,比形态和繁殖试验有用,因此可作为研究数量有限物种的一个方便的选择。

Jones 等人 (2006 年) 用低倍镜和分类探针的组合，首先利用 18S 针成功地将所有线虫分配到他们特定的分类组，然后进行Real-time PCR，利用复用探针和特定引物作用于该分类群，可以进一步判断物种水平下的线虫。用正在发展的Real-timePCR来监测线虫类别使19种来自四个不同群落，以微生物为食的线虫能够被识别。

当前的发展现状是要实现以DNA成熟度作为指标，使线虫群落在系统发育中成为单系群落，并利用特定的引物定量监测每个线虫群落，从而提供一个分子结构上的群落分析，而不是形态学分析的目标。

3. 分子生物技术与形态学方法比较

要从当前的形态学方法过渡到未来的分子方法，至关重要的是得到一个传统形态学方法和分子方法之间相关性的分析结果。分子生物技术需要能够反映特定物种的相对丰度或功能。

格里菲思等人 (2006 年) 结合形态学和分子测序通过线虫的分子生物学特性分析线虫群落，但是发现线虫小杆目和垫刃目的分子特征与其形态学特征比，其代表性不够。要使线虫数量和线虫 DNA 的量保持更好的关连性，至少要知道每种类型的总生物量，而不是每个类型的丰富度，这就难以使用一些分子的数据来计算线虫作为生态指数。在螨群落的研究中，吉等人 (2008 年) 认为将永远不会将这两种方法进行结合 (分子，形态) ，因为有太多步骤无法实现 100%回收或效率。在形态学方法中，样本中所有生物的 DNA 不可能以同样的效率被放大或二次抽样，这可能将会阻止我们明确所有的个体。

目前，有越来越多比较分子技术和形态学方法的研究工作在进行。Okada and Oba (2008)对线虫群落的DGGE 和形态学鉴定的结果进行了比较，发现这两种方法之间的相关系数不是非常大 (0.400e0.603)，但是非常重要。有趣的是，他们认为通过形态学分析得到的结果可能不能反映 真正 的群落，这是因为形态学鉴定比较麻烦，所以只有150个体被鉴定且未复制。Wang et al. (2008) 用PCR-DGGE和形态学分析的方法检测了铜污染对土壤线虫多样性的影响,并发现PCR-DGGE能得到更多关于线虫属的信息,条带亮度可以反映出线虫的丰富度。Hamilton et al. (2009)通过以DNA序列为基础的分子方法得到的结果与使用传统的、 基于显微镜的方法得到的结果比较，发现两者大致相同。然而，由于固

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