产CP1蛋白酶的中度嗜盐菌假交替单胞菌属CP76菌株的分离及鉴定
作者：C Saacute;nchez-Porro，E Mellado，C Bertoldo，G Antranikian，A Ventosa

摘要：本实验总共分离筛选了26株产蛋白酶的中度嗜盐菌。筛选得到的大部分菌株为Salinivibrio（16株），其余菌株被鉴定为Bacillus（4株），Salinicoccus（2株）、c-Proteobacteria（4株）。而筛选得到的CP76菌株是产胞外蛋白酶最好的菌株，尤其是CP1蛋白酶，因此我们对该菌株做了进一步研究。同时，为了确定菌株在假交替单胞菌属的地位，我们对微生物进行了16S rRNA 序列分析及表型分析。研究发现，在菌株指数生长期结束的时候所检测到的蛋白酶产量是最大的。将CP1蛋白酶纯化然后观察生化特征，结果发现在55°C，pH值为8.5时该酶活性最大，并且能忍受广泛范围的高浓度 NaCl（0到4 M NaCl)。而这种酶最有趣的特点就是它的耐热性，pH值活性范围较大（6-10），以及耐盐性（最适NaCI浓度为7.5%）。该酶的分子量为38 kDa，与先前描述的金属蛋白酶N-端氨基酸序列测定结果相似。其活性受EDTA，PMSF和Pefabloc的强烈抑制。然而用糜蛋白酶抑制剂E-64、乌苯美司或亮肽素并没有检测到显著的抑制作用。这些结果表明Pseudoalteromonas sp. strain CP76产生的胞外蛋白酶具有耐热性和高度耐盐性。

关键词：极端微生物；噬盐菌；蛋白酶；假交替单胞菌属

引言

细菌蛋白酶是一种被广泛研究的能够催化蛋白质完全水解的酶。除了自身生理特征十分重要以外，还是一类具有重大作用的工业酶(Rao et al. 1998)。经过研究实验，已经从几种嗜温微生物中分离纯化得到蛋白酶，并且做了基因克隆(Rao et al. 1998)。但是目前还没人研究从嗜盐微生物中提取蛋白酶。一些古细菌进化分支的极端嗜盐菌产生的一些蛋白酶已经被分离鉴定(Norberg and Hofsten 1969; Kamekura and Seno 1990;Kamekura et al. 1992; Stepanov et al. 1992; Ryu et al.1994; Gimeacute;nez et al. 2000),但是至今为止没有从中度嗜盐菌分离提取蛋白酶的相关研究(Ventosa et al. 1998)。中度嗜盐菌能够在广泛范围的盐浓度下生长（最适NaCl浓度为3-15％），它们在生物技术方面有巨大潜力。为了筛选分离得到中度嗜盐菌的蛋白酶，需要进行酶的的表性分析和基因克隆。在工业生产过程中使用嗜盐菌有利于在高盐浓度下产生蛋白酶(Ventosa et al.1998)。这些酶在生物技术具有极大的应用潜力,但是我们需要更好的了解嗜盐菌的内在的抗盐属性和在极性环境中具有活性的稳定机制。

为了得到产蛋白酶的中度嗜盐菌，我们进行了分离筛选。从盐田里分离筛选得到26株产蛋白酶的中度嗜盐菌。筛选得到的CP76菌株是产胞外酶最好的菌株。然后将得到的CP1蛋白酶进行分离纯化及生化鉴定。该酶的耐热性和耐盐性使其在工业生产上具有极大的应用价值。而且有利于阐明嗜盐微生物产酶的稳定性的分子机制。据我们所知，这项实验是第一个关于从中度嗜盐菌分离和筛选蛋白酶的研究。

实验方法

细菌菌株和培养条件

将菌株放在盐培养基上进行常规培养，并补充加入浓度（w/v）为10％的总盐（SW-10）以及0.5％（w/v）酵母提取物(Ventosa et al. 1982)。必要时，将不同浓度的盐混合物加入到基础培养基。在不同的时间内，用Perkin-Elmer分光光度计测得吸光度在600nm的CP76菌株生长曲线，以观测菌株生长情况。同时，将50ml的SW培养基放在250ml的烧瓶中，每一个培养基接种500ul的菌种进行固相培养，并放置在37℃以及250rpm的New Brunswick的环境下进行摇床培养。培养条件对蛋白酶产量的影响情况是通过检测菌株在加入不同碳水化合物如乳糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、甘露糖醇、果糖、葡萄糖（50 mM）、氯化铵（50 mM）、酪蛋白、酸（Difco）（1％）的SW-7.5培养基中的生长情况来判断。生长监测的方法跟之前一样，培养24小时后测定蛋白酶活性。

菌株蛋白水解活性的筛选

从Isla Cristina (Huelva, Spain)的水、太阳能盐场和高盐度的土壤底泥中总共分离得到310株中度嗜盐菌。在采集标本后的6小时内，要其放置在无菌塑料容器并接种。为了定性筛选出蛋白水解活性高的菌株，将其放入加入了0.5％（w/v）酵母提取物（Difco）和1％蛋白胨的盐培养基。并加入20g/l细菌，然后用琼脂（Difco）固化培养基。

分离和鉴定

为了在分类学上鉴定菌株的形态，生化，生理和营养特征，我们查阅了资料。采用了已经提出的方法进行了革兰氏染色，过氧化氢酶，氧化酶，生长在无氧条件下和其它生化试验测定 (Ventosa et al. 1982)。总共有95株菌株的营养特征的可以通过生物学自动识别系统进行识别(Biolog Inc., Hayward, Calif., USA)。菌株接种到分离培养基上，并在37℃下培养24小时，然后悬浮在预热的无菌盐水培养基（3％NaCl）中，密度范围控制在制造商制造的生物光度计型号21101指定的密度范围内。在生理盐水溶液中的细胞悬浮后，立即将悬浮液转移到无菌多通道移液器储层。将Biolog微生物GP（革兰氏阳性）以及GN（革兰氏阴性）的细胞悬浮液通过8道的重复吸管装置每孔装入125 ul并接种到微孔板上。然后将接种了Biolog微生物培养板放在在37℃培养24小时，并用Microlog 3.59酶标仪进行测量，计算机软件进行自动读数。

基因组DNA分离和16S rDNA序列分析

将CP76菌株的DNA进行萃取和沉淀之后，根据CTAB协议进行细菌基因组DNA分析(Wilson1987)。按照先前描述的详细的方法，通过引物16F27和反向引物16R1488进行正向16S rRNA基因的PCR扩增(Mellado et al. 1995)。直接使用自动化DNA循环测序对进行PCR扩增的序列进行测定(LiCor)。根据Arahal等人详细描述的方法使用ARB软件进行数据分析(2001)。

制酶方法

通过Kunitz改进的检测蛋白水解活性的方法（1947）如下。将含有0.5％（wt/vol）酪蛋白（Hammarsten; Merck）的样品（一式两份）放在50mM的pH值为8.5Tris-HCl缓冲液，然后将其放在最适温度和pH水浴培养30到60min。加入500 ul的10％（wt/vol）的三氯乙酸使酶反应停止，然后在室温下保存十分钟。在13,000rpm下测定反应混合物(Heraeus Sepathec, Osterode, Germany) 的吸光值以及在吸光度280nm测定一个空白管（非孵育样品）的吸光值。一个单位的蛋白酶被定义为在限定的等效检测条件下得到1 umol酪氨酸所需的酶的量。测定的蛋白质浓度根据Bradford (1976)。

凝胶电泳

从NOVEX购得含有4-20％的梯度天然聚丙烯酰胺凝胶(MBI Fermentas, St. Leon Rot, Germany)。凝胶在120 V、4℃运行16小时。将高分子量标记蛋白（Pharmacia Biotech）作为标准。为了检查蛋白酶的亚基组成，通过十二烷基磺酸钠进行硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分析蛋白质样品，并按照Laemmli (1970) 描述的那样将样品放在60℃下加热10分钟。将低分子量标记蛋白质（Pharmacia Biotech）作为标准。将下列进行SDS-PAGE的蛋白质用Commassie（0.1％）染色。根据Heussen和Dowdle（1980），以0.1％（(wt/vol)）明胶作为酶作用物，原位检测被染色的酶的蛋白水解活性。将凝胶放溶有0.6％（wt/vol）氨基黑的水-乙醇-乙酸（60:30:10）的溶液中1小时中，然后放在水-乙醇-乙酸（60:30:10）溶液中脱色。

CP1蛋白酶纯化

将CP76菌株培养后，将培养液放在12000g离心30分钟，得到的无细胞上清液放在20mM/100体积的Tris-HCl，pH值8.5（缓冲液A）中进行透析。然后将上清液加到用缓冲液A平衡过的Q-Sepharose柱（2.5·21cm），直到在280nm处检测不到吸光度。将该柱用缓冲液A清洗，并将蛋白质用含线性0-0.5 M氯化钠梯度的缓冲液A洗脱。通过超滤浓缩将活性馏分合并，并加入含20mM/100体积的Tris-HCl ，pH值为8.5的含有0.1M NaCl的缓冲液B。将浓缩的样品加到在Pharmacia快速蛋白质液相层析的Superdex S—200制备柱（(1.5·96 cm; Pharmacia Biotech），连接到Pharmacia FPLC系统将缓冲区B平衡。在相同缓冲液中以1ml / min的流速洗脱，以1mL为单位收集馏分。通过SDS-12％PAGE对含酶组分进行分析。

pH，温度，和NaCl的影响

通过使用上述相同的协议确定pH对蛋白酶活性的影响。但用120mM通用缓冲液代替Tris-HCl缓冲液，以获得从pH 3.5到10.0的值。所有的试验均在55℃下进行。为了确定温度对酶活性的影响，将样品放在25℃到75℃的温度下培养30min。在不同温度下用120mM、pH8.5的通用缓冲液将样品进行培养后，探究耐热性。培养一段时间之后，提取样品并离心澄清，然后测定酶活性。按照先前描述的标准协议在0到4M NaCl之间确定NaCl的影响。

金属离子和蛋白酶活性的抑制剂的作用

为了检测各种物质对蛋白酶活性的影响，在纯化的酶（0.2U/ml的最终浓度）中加入各种浓度的金属离子和其他试剂在55℃培养60min。在不同最终浓度，加入蛋白酶抑制剂如抗蛋白酶，苯丁抑制素，抑糜蛋白酶素，E-64，EDTA，亮肽素，胃蛋白酶抑制素，磷酸阿米，Pefabloc，苯甲基磺酰氟（PMSF）和抑肽酶制成酶的混合物。将含有0.5％酪蛋白和pH 8.5的50mM Tris-HCl缓冲液以及5ul酶的混合物溶液（450ul），放在室温下培养1h以及55℃下培养60min。如前所述，用同样的步骤测定残留的

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