利用GC-MS对石斛兰的不同起源和物种进行相似性分析及利用FTIR对其进行多糖分析

Nai-Dong Chen,1,2,3 Nai-Fu Chen,1 Jun Li,3 Cai-Yun Cao,1 Jin-MeiWang,1 and He-Ping Huang4

使用气相色谱-质谱联用法结合多糖的红外光谱技术对野生型和组织培养的霍山石斛、铁皮石斛、细茎石斛及3种野生石斛——河南石斛、美花石斛和玫瑰石斛进行相似性分析。每种石斛样品中均含有木糖、树胶醛醣、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖和半乳糖醛酸这8种单糖，且在不同来源及物种间的石斛样品中的单糖含量的变化异常显著。基于气相色谱-质谱联用法的进一步相似度评价的数据显示酮含量在不同来源的霍山石斛、铁皮石斛和细茎石斛中分别为0.831、0.865、0.884，而物种间的酮含量分布在0.475到0.835间。红外色谱仪的对组织培养的霍山石斛、铁皮石斛及细茎石斛的多糖数据显示其相似系数分别为88.7%、86.8%、88.5%，与其相反的是物种间的相似系数在57.4%到82.6%间变化。这些结果表明不同来源的调查所用的石斛中所含的多糖的结构可能比我们所预计的要更多。

1. 前言

石斛属是兰科植物中的第二大属，中国能找到石斛属中的70多种植物^[1,2,3]。包括霍山石斛、铁皮石斛、细茎石斛、环草石斛、玫瑰石斛在内的一些石斛属的植物的茎中含有丰富的活性化合物，多糖含量尤为丰富^[4]。由于石斛具有治疗肚子疼、滋阴清热、提高免疫力、抗肿瘤^[5-7]的功效，已经成为中药材和营养品，因此，对药用石斛的需求也日益增长从而导致过度开采和消耗一些野生植物资源，例如霍山石斛、铁皮石斛和细茎石斛，导致其濒临灭绝。在传统中药方面，组织培养的石斛已经成为主要的石斛药材资源。石斛作为药用植物，与野生植物相似能产生相似化学成分的组织培养的药用植物是非常重要的。在中药产业中，建立一种快速鉴定品质的技术去评估野生和组织培养的石斛的相似性对于确立其质量和安全性是一个关键步骤。迄今为止，发表的植物化学实验已经证明多糖的生物活性与单糖的组成及聚糖比率密切相关^[8]。对于多糖的单糖组成的分析，是对于进一步研究其理化特性、结构和结构活性间关系的一个最重要的步骤，因此这对于基于多聚糖的药物和具有增强体魄功效食物药剂是一个重要的参数^[3,9]。据药理学研究表明，作为石斛植株中一种主要的生物活性成分，石斛多糖显示了多种增强人体体质的功效，例如免疫激活^[10,11]，增强免疫力^[9]及抗肿瘤功效^[12-14]。因此，对于掌握不同来源和物种的石斛中的单糖含量和成分是否相同的信息异常重要。

在本研究中，作为我们在研究组织培养及野生型石斛间关系的一系列工作，运用GC-MS和红外光谱技术来分析不同起源的霍山石斛、铁皮石斛和细茎石斛及另外3种野生石斛物种间的多糖差异。基于气相色谱联用仪和红外光谱技术的结合，指纹图谱提供了来自中药的多糖的综合信息，这将对来自不同来源和物种的药用石斛的质量评估非常有用，指纹图谱同时也提供了通过植物组织培养技术来利用和保存珍稀和濒临灭绝的药用植物的新视角。

2. 实验

2.1 植物材料

当前季节的植株组织培养的茎和野生霍山石斛、铁皮石斛和细茎石斛，野生霍山石斛（表 1）是在2013年10月从安徽霍山县采集，野生环草石斛和玫瑰石斛是在2013年10月广西桂林采集。所有的植物材料是由安徽生物技术研究中心的植物细胞工程学教授Nai-Fu Chen鉴定。凭证标本（表1）存放在皖西学院的生物技术和制药工程学院里的植物标本馆。

所有的石斛样品均在阳光下干燥并分别剪裁成小片，然后每5克干燥样品都要经过GC-MS和FTIR技术对多糖进行多级分析程序的分析研究。

2.2 样品及化学试剂

石斛多糖经热水抽提和酒精沉淀获得。简而言之，干燥的石斛粉末是在80℃95%酒精（质量体积浓度为1:50）脱脂3次，每次3小时，然后在90℃下用蒸馏水（质量体积浓度为1:10）萃取3次，每次3小时。混合提取物是在一个压力逐渐减小的环境下进行集中浓缩，然后将浓缩液在4500转/分钟的条件下离心15分钟。提取上清液，并用100%的乙醇缓慢加到上清液中并混匀使多糖沉淀。最后一次用76%的酒精进行浓缩然后置于4℃冰箱中存放24小时。多糖颗粒在5000转/分钟的条件下离心15分钟，每次经酒精、丙酮和乙醚反复洗涤而获得。将精制多糖颗粒完全溶解在适当体积的蒸馏水中，并经过谢瓦格抽提法重复抽提过滤除去蛋白。最后，将滤液冻干产生精制的石斛多糖晶体。

乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、盐酸和吡啶是从化学试剂国有控股有限公司（中国北京）购买，六甲基二硅氮烷和三甲基氯硅烷是从阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）购买，己烷、肌醇、木糖、树胶醛糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖和半乳糖醛酸是从Sigma-Aldrich（德国）购买。水经Milli-Q系统蒸馏。从化学试剂国有控股有限公司和阿拉丁生化科技有限公司购买的试剂属于分析等级，来自Sigma-Aldrich的化学药品和试剂属于层析级。

2.3 GC-MS分析

气相色谱-质谱联用分析是由追踪1300种气体分子的气相色谱仪与ISQmass光谱仪系列的设备包括TriPLUS RSH自动进样器。三甲基烷脂的O-甲基单糖是在一台TG-5熔融石英毛细管柱中分离开（30mX0.25mm，0.25um膜厚度）。温度系统维持从初温125℃到155℃间每次变化1.5℃/分钟，到171℃每次变化0.8℃/分钟，到180℃每次变化9℃/分钟。运载气体是氦，其流速维持在1ml/min，分流比是20:1，注射温度为250℃，注射体积是2ul。存储系统的传输线和离子源分别是250℃和280℃，存储系统的模式是电子电离。质量范围检测为50-350amu。

2.4 GC-MS技术识别和量化单糖

气相色谱-质谱联用分析技术是根据Guadalupe等提议的方法建立^[15]。单糖的组成是由GC-MS的三甲基硅烷脂鉴定的单糖O-甲基乙二醇衍生物得到的甲基和衍生化决定。为了将它们分解成为其相应的甲基单糖，每个石斛样品的20mg的多糖经1.5ml的甲醇分解试剂（0.5M的甲醇与盐酸的混合物）处理，该反应发生在80℃的氮保护气中维持16小时，其后多余的反应物与一系列的氮气反应移除。通过增加0.5ml的混合物吡啶：六甲基二硅氮烷：三甲基氯硅烷（10:2:1体积比）使甲基糖苷转变成其三甲基硅烷衍生物形成干物质，该反应在80℃条件下持续30分钟，反应物的移除通过使用一系列的氮气。一种肌醇衍生物溶液（25ml）作为内部标准加入其中，多余的衍生物则被1ml的己烷萃取出来。总循环模式为2ul的溶液和样品混合物等分为2份。不同标准的糖类同样也转变成为相应的三甲基氯硅烷衍生物，为了获得识别和标准校正曲线，将采用气相色谱-质谱联用技术进行分析。

2.5 红外光谱分析

红外光谱分析技术是我们先前论文中已经发表过的一种技术^[16,17]。红外光谱分析是由装有高性能氘Triglycine硫酸盐(壳体)检测器的Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪（美国的赛默飞世尔科技公司）在4000-400/cm的范围内进行记录。红外光谱仪安置于一个装有空调的房间（25℃，50%相对湿度）里。

冷冻干燥的石斛多糖在一个搅拌器中形成粉末，并通过200-孔筛进行筛选。每个样品与光谱级的溴化钾粉末均一地混合（1:100的质量百分比浓度），然后将其压成小球状进行红外光谱分析。每个光谱都是从总数为36的扫描分辨率4/cm的coadded中计算得到，纯净的KBr为背景的光谱在样品分析前进行记录。每个样品的扫描重复5次。每个样品的扫描是为了对每个样品的浓度和平均光谱进行检查以用来进一步的分析。先前的数据分析中，每个平均光谱是校正基线，并用Windows软件的频谱来使标准吸光度变得准确，因此最强烈的吸收峰是设置一致的。

图1 TMS甲基的标准单糖TIC色谱分析方法

树胶醛糖（峰1、2、5、6），甲基戊糖（峰3、4、7、9），木糖（峰10-13）、甘露糖（峰14-16、19），半乳糖（峰17、18、20、21），葡萄糖（峰22、28、29、32），半乳糖醛酸（峰23-26、30、31）及海藻糖（峰27、33）

2.6 相似性评估

基于气相色谱-质谱联用技术数据的多糖的相似性是由使用包括三角曲线和17.0SPSS软件版本在内所得出的相关系数（rcor）决定；多糖的单糖组成是由计算得出。基于红外光谱分析技术的相似性评估是在使用装有相似性系数算法的软件的iS10 Nicolet傅里叶变换红外光谱仪自动计算所获得^[16,17]。

3.结果与讨论

3.1 用GC-MS识别和量化的糖残基

在9种石斛样品中多糖的单糖组成是由GC-MS的三甲基硅烷衍生物鉴定同时肌糖作为内部标准。峰值的识别是将其保留时间和集中的光谱与那些因注射和获得的纯理论的标准相对比。在我们的实验中，所有的单糖均转变为其相应的三甲基硅烷甲基糖苷衍生物，此结果由GC-MS分析得出。在第四和第七的吸收峰中拥有每种单糖。多倍的吸收峰相当于三甲基硅烷甲基糖苷衍生物的alpha;和beta;的异构体，吡喃环由单糖构成。对于9种石斛样品的标准单糖和多糖的典型GC-MS色谱图，如图1和图2。包括L-树胶醛糖、甲基戊糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖醛酸和果糖在内的总共8种单糖在9种研究的石斛中均能识别。

为了在GC-MS色谱图中量化单糖，8种识别的单糖的标准曲线在离子监测模式中监测得到，在每个混合物中的一段筛选适当数量的离子需要7到32分钟：204个离子的D-半乳糖醛酸、L-甲基戊糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖以及217个离子的树胶醛糖。对于所有的光谱，这些离子是基峰，并拥有最丰富的离子，并为了记录离子监测模式的色谱图而筛选出来。

GC-MS检测到的趋势在表2中列出来了，其中包括反应式、标准偏差的斜率、相关系数、线性范围和对于糖类的检测极限及定量极限标准。每种单糖的检测极限通过注入之前在衍生物程序中提到过的一个标准的衍生物混合物，接着就是用3种指定的检测极限（LOD）的信噪比以及10种指定的定量极限（LOQ）来比较每种峰高。GC-MS技术的趋势在使用标准糖类解决方案的线性度研究后建立。分析所得的内部标准的峰值的面积比被用来作为构建校正图的分析信号。检测极限用来计算3种信噪比的集合和10种信噪比的定量极限。

在校正曲线中得到的相关系数都比0.96要高。因此，这些校正曲线被认为是研究线性浓度范围的研究（1500-1600ug的树胶醛糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，550-600ug的海藻糖和木糖，1300ug的半乳糖醛酸）。检测极限和量子化都是好的，在所有情况下均低于存在于9种石斛样品中的单糖含量。校验的建议方法是在分析石斛样品后提出的，GC-MS技术的精度是依据方差分析的重复性和再现性（表2）来检查。重复性是在基础操作环境中由6个重复的相同石斛样品的分析评估得来，这个表示成相对标准偏差值。再现性技术是由3批的待研究石斛的分析评估得来，这个表示成相对标准偏差值。就如实验中所展示的一样，样品是脱脂的，经热水萃取，乙醇沉淀，谢瓦格抽提法脱蛋白得到。收集到的残留物经冷冻干燥、甲基化、脱蛋白化并经过GC-MS的分析来计算糖类的数量。重复性和再现性的数值都考虑到一个多步过程的执行值分别介于1和11%以及7和12%之间。在多糖的单糖组成上得到的9种研究的石斛的分析结果分别都列在表3中。

所有调查发现，在我们的实验条件下，石斛获得相同的单糖成分在糖的不同起源和物种之间的内容明显不同。例如，来自于TCDHS的多糖中甘露糖和葡萄糖的组成为62.0plusmn;1.2和27.0plusmn;1.1%，几乎是那些来自于W-DHS（分别为32.2plusmn;1.1以及14.6plusmn;0.9%）的两倍和来自于W-DL（分别为17.9plusmn;0.9%以及11.3plusmn;0.3%）的3倍（表3）。总共9.6plusmn;0.5%的半乳糖醛酸中检测出TC-DO多糖，而只有0.1plusmn;0.0%的半乳糖醛酸是在W-DO中检查得出，多糖的半乳糖醛酸的组成在TC-DM中检测出的相当于是其野生型中的2倍还多。半乳糖在W-DHS和W-DO中的组成分别为25.8plusmn;1.3%以及13.8plusmn;0.7%，明显高于那些在TC-DHS（2.2plusmn;0.9%）以及TC-DO（3.3plusmn;0.3%）。因此，9种石斛样品可以近似地辨别出来。

我们注意到高含量的甘露糖是在研究石斛的多糖中被发现（甘露糖比率为17.0%-67.9%，表3）。葡萄糖、半乳糖、海藻糖的含量也很高，多糖的3种单糖的总含量为27.5%（TC-DO，表3）到71.8%（WL-DL，表3）。这些结果表示石斛多糖是包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖和海藻糖、树胶醛糖、木糖、甲基戊糖在内的杂多糖，其中海藻糖是主要的组成成分，其中半乳糖醛酸是主要的组成成分。

以上所述的分析说明多糖的结构是在研究的组织培养的石斛及其野生型间可能是不同的。此外，单糖成分的变异可能为识别和鉴定9种石斛提供了新的方法。

图2 多糖中单糖的GC-MS方法比较从九石斛兰样品经TMS刺激甲基的方法

树胶醛醣(峰1、2、5、6

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