观赏李属的快速繁殖和法国樱桃GF305

——李属植物病毒指标

Anna Kalinina ▪ Daniel C. W. Brown

摘要：以P. americana（美国李），P. cistena（紫叶沙樱桃）, P. glandulosa（腺叶李）, P. serrulata lsquo;Kwanzanrsquo;（石楠樱），P. laurocerasus（桂樱），P. sargentii（日本晚樱），P. tomentosa（野生毛樱桃），P. triloba（榆叶梅），P. virginiana rsquo;Schubertrsquo;（加拿大野樱桃）九种观赏李属植物进行快速繁殖，这在北美极具商业价值，而法国樱桃GF305通常被用作李属病毒索引。基于植物组织培养的繁殖周期可在五个月内完成，包括由体外引入分生组织的建立组织培养，芽增殖，生根诱导和植物驯化等步骤。对分生组织进行杀菌处理可减少细菌和真菌污染。使用1mg/l 6-苄基腺嘌呤促进观赏李属丛生芽形成。改变糖组合物，用果糖代替蔗糖，加入1mg/l阿魏酸的处理对法国樱桃GF305的芽增殖率和体外培养维护有显着的影响。改良生根和植物驯化条件实行两步方案，首先是使用吲哚-3-丁酸（IBA）进行四天的根诱导，再用含IBA 的自由培养基进行三周的根伸长培养。用蛭石作基质对根条进行一个月的培养，结果发现茎叶和根系有额外的生长，并能提供更好的驯化和植物恢复。因此，快繁方法可以保持李属植物的克隆属性以及支持分生组织治疗以抗击病毒感染。

关键字：P. Americana，P. cistena，P. glandulosa，P. serrulata lsquo;Kwanzanrsquo;，P. laurocerasus，P. sargentii，P. tomentosa，P. triloba，P. virginiana lsquo;Schubertrsquo;，病毒索引，分生组织疗法

缩略语

BA 6-苄基腺嘌呤

IBA 吲哚-3-丁酸

GA 赤霉素

TDZ 1-苯基-3-（1,2,3-噻二唑-5-基）

（噻苯隆）

NAA alpha;-萘乙酸

FA 阿魏酸（反式-4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）

MES 2-（N-吗啉代）乙磺酸

MS Murashige和Skoog（1962）基本盐培养基

（植物技术实验室，堪萨斯州，美国）

QL Quoirin和Lepoivre（1977年）基本盐培养基

（植物技术实验室，堪萨斯州，美国）

SAM 芽顶端分生组织

AXM 腋芽分生组织

MP 分生组织增殖培养基

SP 芽增殖培养基

RM 生根培养基

介绍

李属植物包括200余种的落叶或常绿乔木和灌木，广泛分布在温带地区，具有观赏价值。观赏李品种长着白色、粉色或红色的花，花形呈碟状、碗装或者杯状，有五片花瓣，单生或两朵簇生，如美国李、腺叶李、野生毛樱桃和榆叶梅。有些品种有闪亮多彩的树皮和美丽的秋季叶色，像P. serrulata lsquo;Kwanzanrsquo;（石楠樱）。另外，比如紫叶沙樱桃和加拿大野樱桃，拥有迷人的紫色或绿色的蜡质枝叶。长势紧密的品种如桂樱，可用作地被植物和绿篱。在北美气候条件下，大部分观赏樱桃的商业重要性在于其造型美观，丰富的植被，朴实无华生长条件和高适应能力。法国樱桃GF305（P. persica GF305）通常用于接枝不同的重要商业价值的樱桃品种和一种指示植物，进而进行病毒索引(Bernhard and Marenaud 1969; Gentit et al. 1998)。在建立分子生物学之前的三十多年，确定和描述的几个退化李病毒和病毒样疾病唯一途径是基于法国樱桃GF305的症状分析，如梅花痘病毒，苹果褪绿叶斑毛滴虫病毒，西梅矮缩病毒，李属坏死环斑病毒，番茄环斑病毒，桃潜花叶类病毒，欧洲核果黄化植原体和桃小行星斑剂(Desvignes 1976; EPPO Panel on Certification of Fruit Crops 1992)。

大多数李属的传播与新品种产生是靠传统的杂交，种子和克隆（扦插）繁殖而来。这样做费时费力，且往往只适用于少数品种(Matt and Jehle, 2005)。此外，最具观赏性的李属植物几乎不产生花粉或能成活的生殖器官。关于于酸樱桃和甜樱桃(Borkowska 1983;Hammat and Grant 1996; Matt and Jehle 2005)，樱桃和桃砧木(Dalzotto and Docampo 1997; Marino 1997; Radice et al. 1999)，李(Mante et al. 1989, 1991; Gonzalez Padilla et al. 2003)，樱桃(Hammerschlag et al. 1987)的快繁技术已有描述。观赏李属只有少数被报道，如野生毛樱桃、金露梅、卡林顿樱桃(e.g.Pruski et al. 2000, 2005)。曾报道过一个短期（3个月）的关于野生毛樱桃和卡林顿樱桃的组织培养方案，结果由于其生根和植物恢复效率低下而终止。大多数方案仅对特定品种进行优化，并不能明确适用于其他的品种或种类。其他用于商业的观赏品种的快繁方法尚未报道，如美国李、紫叶沙樱桃、腺叶李、石楠樱、桂樱、日本晚樱和榆叶梅。一些关于法国樱桃GF305的报告证实在体外条件下顽抗的品种只允许2-3个月的传代培养(Lansac et al. 1998)。本次研究的目的是开发一个关于九个观赏李属和法国樱桃GF305的快繁体系，前者已在北美具有高商业价值，后者作为一个众所周知的作为李属疾病指标的物种，用于植物材料的脱毒认证。

材料与方法

植物材料

九种观赏李品种，P. americana Marshall（美国李），P. cistena叶矮樱（红叶李times;白榆）（紫叶沙樱桃），P. glandulosa Thunb（腺叶李），P. serrulata Lindl.lsquo;Kwanzanrsquo;（石楠樱），P. laurocerasus L.（桂冠樱桃），P. sargentii日本晚樱（萨金特樱桃），P. tomentosa野生毛樱桃（南京樱桃），P. triloba榆叶梅（开花杏）和P. virginiana L. lsquo;Schubertrsquo;（野樱桃）(Encyclopaedia of Garden Plants 1997)（从尼亚加拉地区（加拿大安大略省）苗圃获得），法国樱桃的种子（Batsch）lsquo;GF305rsquo;，来自法国波尔多INRA研究站，分别用于建立体外培养。

体外培养李属的建立

从已在温室中种植一年的美国李、紫叶沙樱桃(图1a)、腺叶李、野生毛樱桃、榆叶梅、加拿大野樱桃和法国樱桃GF305 (图1g)中 取芽顶端分生组织(SAM)，从长在田间的石楠樱、日本晚樱和桂樱的树枝处取腋芽分生组织(AxM)用于体外培养的建立。木枝的发芽处理(Murashige and Skoog 1962; PhytoTechnology Laboratory, KS, USA)是使用一种破芽培养基，即在半强度的基本盐培养基里添加6-苄基腺嘌呤（BA），吲哚-3-丁酸（IBA）和赤霉酸(GA)(表1)。带几个2-5毫米长叶原基的芽尖外植体表面可使用70%的乙醇消毒30s，之后在15%的漂白剂和0.02% 聚山梨酸酯20溶液中浸泡摇晃15分钟，随后用无菌蒸馏水洗净。将外植体放置在分生组织增殖培养基(MP1-5, 表 2)。4周后，外植体转移到芽增殖培养基（SP1或SP2，表2），每月传代培养。

生根培养和植物驯化

从4周的李属植物组织培养中获取1-2cm长的芽外植体，垂直放置于不同的生根培养基(RM1-8，表3)，在三种不同的时间段里培养4周(表4)。

实验1：在RM1或RM5进行28天的芽增殖；

实验2：在RM1或RM5进行4天的增殖后，将芽转移到RM2或RM6；

实验3：在RM3或RM7进行4天的增殖后将芽转移到RM4 或 RM8。

将成功生根的外植体转移到一个蛭石培养基(中等大小的蛭石，Therm-O-Rock East Inc., PA, USA)。这种培养基含有盐和维生素的1/2MS（见表1所用维生素），不加糖，生长调节剂和细菌用琼脂，分装于品红容器。培养一个月使新形成的根系适应土壤条件。一个月后，将植物转移到的装有ProMix lsquo;BXrsquo;土壤混合物的容器（ProMix lsquo;BXrsquo;，总理园艺有限公司，加拿大），放置在生长室（＋25plusmn;2℃，16 h光照，800–850 mu;mol▪M–2S–1，湿度75%），在光照下保持连续灌溉1/5MS无机盐溶液一个月，再转移到温室。

介质与生长条件

所有的固体介质包含0.8％细菌用琼脂（费舍尔，USA）和0.5g·L-1MES（2-（N-吗啉代） -乙酸）；在高压蒸汽灭菌前，用1M的KOH将pH调到5.7-5.8。用添加15g·l-1果糖和1mg·l-1阿魏酸（反式-4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，FA）（表2,3）的QL基本盐培养基（quoirin和lepoivre 1977植物技术的实验室，堪萨斯州，美国）作为法国樱桃GF305的芽增殖培养基。其中，维生素和生长调节剂须经滤波器灭菌，并在需要时加入高压灭菌介质。介质被分配到100times;25-mm培养皿（每板40毫升）或品红容器（品红，芝加哥，Il，USA），具体到每容器60毫升。组织培养在 25plusmn;2℃的培养室，采用全谱荧光灯提供的16 h光照周期，（通用电气“，”Starcoat，F32T8/ SP41，加拿大），强度在300-350mu;mol·m-2s-1。除非有特殊情况，否则所有的化工产品都是从美国购买的。

结论

观赏李属和GF305 peach体外分生组织增殖系统的建立

SAM和AXM灭菌方案将温室和田间材料的细菌或真菌污染频率降低到一个非常低的水平（我们估计小于1％的视觉培养污染）。在含0.5mg·l-1BA，0.5 mg·l-1 IBA和2 mg·l-1GA的MP1中，紫叶沙樱桃(图1b)和榆叶梅的SAM呈现高增值率，分别为94和66%（表5）。在含2mg·l-1BA的MP2中，石楠樱、美国李和加拿大野樱桃的SAM和AxM的增值率分别为75%，100%和50%。在含2.75mg·l-1 1-苯基-3-（1,2,3-thiadiazol-5-yl）脲（苯基噻二唑脲）（TDZ）和0.5 mg·l-1 IBA的MP3中，腺叶李、日本晚樱和野生毛樱桃的SAM和AxM的增值率分别为100%，100%和85%。基于QL基本盐和15 g·l-1果糖，并添加0.5mg·l-1BA，0.5 mg·l-1 IBA和2 mg·l-1GA的MP4更适于法国樱桃GF305的SAM增殖，超过75%的SAM出现增殖情况（表5，图1h）。当在培养基中添加蔗糖时，芽外植体的顶端和腋芽出现凹陷的生长，往往会在茎基部和下部叶产生愈伤组织（图2a）。而添加1mg·l-1FA可促进早期芽组织成熟，形成茎的次生组织，预防含组织瘢痕的芽原基氧化（图2b）。

观赏李属和樱桃（表2）仅在增殖培养基SP1和SP2的第二通道之间的增殖芽外植体上形成腋芽。特别是腺叶李的芽外植体有较高的腋芽形成率，前2个月内平均每个外植体出4.1plusmn;0.6个芽（图3），而其余的品种需要SP1或SP2附加传代（图1c，i）。每个外植体每月形成的腋芽数量是在茎尖分生组织培养建立后的前两年被评估出来的。这个数量值在所有被调查的观赏李属中都是稳定的（图4）。每月记录观察腋芽形成率，其中腺叶李的值最高，为每个外植体生5.37plusmn;0.3个芽，较少的像美国李、紫叶沙樱桃、野生毛樱桃榆叶梅、加拿大野樱桃和法国樱桃GF305在2.01plusmn;0.2到2.65plusmn;0.6之间。而石楠樱、桂樱和日本晚樱的腋芽形成率在1.5plusmn;0.2到1.8plusmn;0.2（图4）。

根的诱导与观赏李和GF305 peach植物恢复

优化观赏李植物和法国樱桃GF305的体外生根培养方案应用了几种不同的介质(RM1-8，表3)和方法(实验 1–3，表 4)。在含3 mg·l-1IBA（实验1，表6）的RM1培养基中，美国李、紫叶沙樱桃(图1d)石楠樱、榆叶梅和加拿大野樱桃成功获得根的诱导和伸长。在RM1中经过4天的诱导和不含IBA的RM2中经过3周的延长后，桂樱，日本晚樱和野生毛樱桃形成根系。而在RM3（含3 mg·l-1IBA的MS无盐培养基）中经过4天的诱导，紧接着在不含IBA的RM4（概述实验3）中进行根伸长的培养后，腺叶李成功形成根系。用含3 mg·l-1IBA，1 mg·l-1FA和30 g·l-1蔗糖的RM5（实验2，i.e.）代替添加果糖的不含IBA的RM6生根培养基（表6），法国樱桃GF305具有较高的生根效率（图1j）。每个外植体的根形成的时间和形成的根数高度依赖于其品种和生长介质（图5）。一般情况下，根出现在快速诱导下的第8和16天之间。有些树种是早生根品种，如美国李、紫叶沙樱桃、野生毛樱桃、榆叶梅、加拿大野樱桃和法国樱

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