第三代抗毒素组学:挑战抗蛇毒血清在体外临床前评估的极限

原文作者：Davinia Pla,Yania Rodriacute;guez and Juan J. Calvete *

摘要:第二代抗毒素组学是一种翻译性的毒素组学方法,旨在补充体内临床前中和试验｡它提供了一系列具有抗蛇毒识别表位和免疫反应受损的同源和异源蛇毒蛋白的定性和定量信息｡许多热带和亚热带地区蛇毒血清缺乏,蛇咬伤死亡率和发病率都很高,在这种令人担忧的情况下,这些信息有可能促进现有抗蛇毒血清完成最佳配置,并有助于合理设计新颖的广泛特异性解毒剂｡本工作的目的是扩大第二代免疫亲和抗毒素组学技术平台的分析能力,赋予其可确定抗蛇毒血清对毒液中存在的不同毒素的最大结合效果的能力,并定量分析特定抗蛇毒血清中存在针对毒液的特异性抗体｡本文章将以抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;针对同源(B. arietans)蛇毒和异源(N. melanoleuca)蛇毒的反应为例,说明这种称为“第三代抗毒素组学”的新型技术平台如何在针对抗蛇毒血清的临床前评估中被应用｡

关键词:蛇毒; 抗蛇毒血清; 抗蛇毒血清的临床前评估; 第三代抗毒素组学; IgG-毒素复合物的体积排阻分析

1. 引言

蛇咬毒害是一种职业性及环境性疾病,每年造成超过95,000人死亡,30万幸存的受害者永久残疾｡这些人居住在世界上最弱势的热带和亚热带发展中国家的一些农村社区中,位于撒哈拉以南非洲,亚洲,拉丁美洲和大洋洲部分地区｡这一问题的规模可能要远远超过医院护理机构所统计的数据｡蛇咬伤不仅是造成死亡的重要原因,而且还加剧了世界上最弱势社区的贫困状况的恶性循环｡尽管世界各地已有超过45家商业机构或政府机构的抗蛇毒血清生产商,但在许多受灾地区仍缺乏经过独立验证,证明安全,有效且价格合理的抗蛇毒血清,这是造成这种热带疾病负担的重要原因｡更复杂的是,越来越多的证据表明,某些市售抗蛇毒血清在临床上是无效的｡尽管抗蛇毒血清本质上是多成分的,但解决这一问题的策略应该包括提高抗蛇毒血清的可用性以及临床前评估抗蛇毒血清有效性的测试｡一种抗蛇毒血清能否进入临床试验(并最终被批准用于临床)的必要先决条件是:对于其在计划使用该抗蛇毒血清的地理范围内,免疫中和医学上相关蛇种毒液最相关毒素成分的能力的评估｡为此,现已制订了简单的实验协议｡世界卫生组织发起了一项针对撒哈拉以南非洲的抗蛇毒血清资格预审计划,是防止使用劣质或无效抗蛇毒血清的重要进展｡该计划也得到了全球蛇咬行动倡议和无国界医生的支持｡

抗蛇毒血清的短缺可以通过设计具有广泛中和范围的改良多特异性抗蛇毒血清来部分抵消,但也可以通过更合理地使用现有的抗蛇毒血清,即系统细致地研究它们的准特异性｡然而,考虑到所有分类水平内及分类水平之间的蛇毒在空间(种群内和种群间)和时间(个体发育)上的变化的充分证据,(我们可以推测)定义抗蛇毒血清的蛇毒交叉反应并不是一件容易的事｡这种情况说明,即使是在密切相关的物种之间,使用系统遗传距离衡量毒液组成亲缘关系的方法是行不通的｡为了评估抗蛇毒血清对物种特异性毒素水平的准特异性,于2008年引入了基于蛋白质组学的拟定方案,称为“抗毒素组学”,目标是以分辨率的形式呈现,量化抗蛇毒血清对同源和异源毒液的交叉反应程度｡最初的方案是基于抗原-抗体复合物的溶液免疫沉淀,然后对上清液中游离抗原进行色谱定量,这种方法仅适用于全IgG抗蛇毒血清｡这种“第一代”方法随后被重新设计用于评估F(abrsquo;)₂和Fab抗蛇毒血清｡这一更新的关键是将抗蛇毒血清挂载在层析基质上,形成免疫亲和层析柱｡这种基于免疫亲和力的“第二代抗毒素组学”方法最有意义的优点是①它能够产生关于未结合毒素和结合毒素的直接信息,②取而代之的亲和柱组分的反相色谱可提供更平滑的基线｡这些改进使得抗蛇毒血清免疫识别的高分辨率和精确定量比原来的免疫损耗方案更优｡在这里,本研究报告了一种进一步更新的方法,使测定抗蛇毒血清对每一种毒液的结合能力成为可能｡此外,该方案被称为“第三代抗毒素组学”,包括对抗蛇毒分子具有免疫亲和力的抗蛇毒血清进行定量｡该平台已用于评估抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;(用于开发第二代抗毒素组学工作流程)对同源B. arietans蛇毒毒素的免疫反应性及其对N. melanoleuca蛇毒的准特异性｡

1. 结果与讨论

2.1抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;对同源Bitis Arietans (Ghana)蛇毒解毒免疫捕获能力

多克隆抗蛇毒血清针对不同蛇毒毒素具有不同的亲和力和不同的抗体量｡通过将抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;孵育在相同的亲和层析柱上,不断增加毒液的挂载量直到饱和,来评估抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;对来自加纳的B. arietans毒液中存在的不同毒素组分的结合能力｡用100-1500 micro;g梯度质量总毒液蛋白孵育的8根亲和层析柱,所得的未免疫结合组分进行比较(图1),显示出浓度相关模式下不同色谱峰的最大结合的程度｡浓度相关模式下的图1中,分离得到的每个色谱组分的毒液的免疫捕获能力的计算结果列在补充资料表S1中,图2用曲线图表示｡主要的PI蛇毒金属蛋白酶(PI-SVMP)和丝氨酸蛋白酶毒素分别在峰26和15(图1a)被洗脱,在300-500 micro;g毒液浓度下,在免疫亲和层析柱上的挂载量达到饱和｡所有其他毒液毒素在毒液浓度900-1200 micro;g之间达到最大结合量｡抗蛇毒血清免疫亲和层析柱可最大结合348.1 micro;g的总蛇毒蛋白,相当于每克EchiTAb-Plus-ICP^reg;IgG分子结合43.5 mg的B. arietans蛇毒蛋白｡

Gutieacute;rrez和他的同事报告了181-312 micro;L抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;的半数有效量｡(ED50,micro;L抗蛇毒血清/mg毒液｡可使18~20 g小鼠对于B. arietans (Nigeria)毒素的LD50的致死率降低50%)这个数字对应每克抗蛇毒血清中和66-114 mg的毒液蛋白的能力｡在最近的研究中,Segura等人和Saacute;nchez等人分别报道了相同的抗蛇毒血清42.3-66.6和27.5-80 mg蛇毒/g IgG的ED50｡EchiTAb-Plus-ICP^reg;能够完全防止更高剂量的致命性质,即667 micro;L抗蛇毒血清/mg毒液,在这种剂量下1 g抗蛇毒血清可以中和31 mg的毒液蛋白｡这些数据与EchiTAb-Plus-ICP^reg;抗蛇毒血清最大毒液蛋白结合能力的研究结果一致｡实验(溶液中vs固定抗蛇毒血清)和生物学(B. arietans蛇毒的地理变异性)特性的结合可能解释了所指出的微小差异｡

尽管很难将抗毒素组学得出的免疫识别水平与抗蛇毒血清在体内免疫中和能力的水平进行比较(虽然两个实验涉及的方案截然不同,但约20-25%的总毒液蛋白免疫捕获能力与体内中和测试的好的免疫中和结果相关｡)在这方面,补充资料表S1显示的结果表明,除了解整合素和kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂外,其他所有毒液毒素在最大结合条件下的免疫损耗程度达到55-93%｡第三代抗毒素组学和体内中和试验之间的良好相关性突出了两种方法在评估抗蛇毒血清中和蛇毒毒性的临床前疗效方面的互补性｡此外,抗毒素组学具有独特的能力,可以为合理化抗蛇毒血清的同源或准特异性功效提供依据,为设计免疫原混合物以生产改善了治疗范围的抗蛇毒血清提供了有价值的信息｡

2.2抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;对异源森林眼镜蛇(Naja melanoleuca,Ghana)解毒免疫捕获能力

对于EchiTAb-Plus-ICP^reg;免疫捕获加纳的N. melanoleuca个别毒素的能力的评估(同上述B. arietans)｡为此,用100~1200 micro;g的森林眼镜蛇毒液蛋白挑战含有8 mg固定抗蛇毒血清IgG分子的亲和柱｡在整个测试的毒液浓度范围内,抗蛇毒血清IgGs未能结合在8-14分钟内洗脱的三指毒素(3FTx)分子(补充资料表S2和图3,4)｡其他毒液被抗蛇毒血清识别,尽管它们与免疫识别位点在不同的抗蛇毒血清:毒液比例时达到饱和,最大结合程度时表现出不同程度的免疫捕获能力:3FTxs在18-22分钟洗脱,vespryn免疫亲和力结合率为12-28%; 富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISP),26-56%; 磷脂酶A2 (PLA₂s),28-63%; PIII -蛇毒金属蛋白酶(SVMPs),31-68%; l -氨基酸氧化酶(LAO),61-73%｡

2.3毒物学指导下的解毒抗毒素组学的预测

8 mg EchiTAb-Plus-ICP^reg;抗蛇毒血清免疫亲和层析柱的总蛇毒蛋白最大结合能力为156.5 micro;g(补充材料表S2)｡这一数字相当于每克IgG分子中和19.6 mg N. melanoleuca毒液蛋白｡假设抗蛇毒血清对毒素的免疫识别程度代表了其中和毒液致死活性物质的能力,10ml瓶的抗蛇毒血清EchiTAb-Plus-ICP^reg;(40 mg IgG/ml; 经计算,N. melanoleuca (Uganda)的ED50为0.66 mg/kg (18-20 g小鼠的95%可信区间为0.49-0.92 mg/kg)),理论上可以中和8-16个LD50｡森林眼镜蛇原产于非洲大陆的中部和西部,是最大的真正的眼镜蛇(眼镜蛇)品种｡每取毒一次,它可以产生0.5-1.1g的毒液蛋白｡因此,可能需要51-102瓶EchiTAb-Plus-ICP^reg;抗蛇毒血清来结合,最终中和如此数量的毒液蛋白｡然而,抗毒素组学数据显示,针对毒素3FTxs毒素的免疫识别能力较差,3FTxs是森林眼镜蛇毒液中最丰富的(占毒液蛋白质组的57%)致命成分｡最相关的是,在8-14分钟内洗脱的alpha;-神经毒素包含24%的N. melanoleuca 毒液毒素,Ld50 lt; 0.2 micro;g/g小鼠,对EchiTAb-Plus-ICP^reg;抗体没有亲和力｡这意味着,整口注射的毒液可以输入高达120-240 mg的3FTxs毒素,这些毒素可以杀死4-8个75公斤的人,而抗蛇毒血清对这些毒素没有效果｡显然,需要进行临床研究来确定EchiTAb-Plus-ICP^reg;对抗N. melanoleuca毒液的有效性｡然而,毒物学和解毒抗毒素学证据强烈表明,这种抗蛇毒血清免疫中和森林眼镜蛇毒液的效果不佳｡

2.4毒液特异性抗蛇毒血清抗体的定量

在几乎所有现有的抗蛇毒血清中,针对非蛇毒抗原的抗体是最丰富的分子｡正常血清和高免疫血清的IgGs在化学和结构上无法区分,对于抗毒素抗体含量的定量很少作为抗蛇毒血清临床前评估的一部分｡然而,这个参数与比较不同公司生产的具有相同名义毒液特异性的抗蛇毒血清的有效性,以及比较同一抗蛇毒血清对同源和异源蛇毒的结合能力有关｡通过免疫化学方法对抗蛇毒血清制剂中治疗分子的相对丰度进行估计已然完成,例如,通过确定效价(ED50表示为每ml抗蛇毒血清中和的毒液mg质量)与总蛋白含量(mg/ml)的比例｡抗蛇毒血清制剂([Abther])中治疗分子的比例可以用公式(Abther)计算:(Abther) = (ED50/(M_ave toxins))/((Ab)/M_Ab),其中“M_ave toxins”即毒液毒素平均分子质量,“Ab”即抗蛇毒血清制剂总蛋白浓度(mg/ml),“M_Ab”抗蛇毒血清活性分子的分子质量( IgG=158 kDa,F(abrsquo;)2=100 kDa,Fab=50 kDa )｡在这里,体积排阻色谱(SEC)洗脱谱分析“增加的毒液:抗蛇毒血清”比率混合物已被应用于定量稳定的“EchiTAb-Plus-ICP^reg;-抗体-B. arietans 毒素”复合物｡SE-HPLC洗脱图谱很容易机械地说明并使用基于质量作用定律的剂量反应函数的数学建模｡

图5展示了定量抗蛇毒血清(300 micro;g)与不断增加质量(12.75-306 micro;g)的 <e

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