剑吻海蛇（Hydrophis schistosus）蛇毒组：一种极简毒素库及异源抗蛇毒血清对其交叉中和作用

Choo Hock Tan^1,3,*, Kae Yi Tan², Sin Ee Lim², Nget Hong Tan^2,3

(1. 马来亚大学医学院药理学系;

2. 马来亚大学蛋白质组学研究中心;

3. 马来亚大学蛋白质组学研究中心)

摘 要：使用反相高效液相色谱仪（HPLC），SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和高分辨率液相色谱—串联质谱法研究了在马来西亚水域捕获的剑吻海蛇（Hydrophis schistosus）的蛇毒蛋白质组。研究结果显示，只有18种蛇毒蛋白符合最低必须限度要求的丰度谱。这些蛋白质属于5个毒素家族：三指毒素（3FTx），磷脂酶A₂（PLA₂），半胱氨酸富集分泌蛋白（CRISP），蛇毒金属蛋白酶（SVMP）和1-氨基酸氧化酶（LAAO）。3-FTx（3种短神经毒素和4种长神经毒素）占总毒蛋白的70.5％，其中55.8％是短神经毒素和14.7％长神经毒素。PLA₂家族由四种碱性异构型（21.4％）和三种酸性异构型（6.1％）组成。含量较少的蛋白质包括一种CRISP（1.3％），两种SVMP（0.5％）和一种LAAO（0.2％）。这是关于马来西亚水域捕获的海蛇中存在长神经毒素、CRISP和LAAO的首次报道。静神经毒素和碱性PLA₂具有高度致死性，在小鼠静脉内的致死剂量小于0.2ug/g。异源抗眼镜蛇蛇毒（单价抗蛇毒血清和神经多价抗蛇毒血清）的交叉中和作用对长神经毒素和碱性PLA₂作用效果处于中等水平，但对短神经毒素的作用则较弱，这表明后者是改善抗蛇毒血清交叉作用所必须克服的限制因素。

关键词：海蛇； 剑吻海蛇； 蛇毒蛋白组； 蛇毒中和； 抗蛇毒血清

前言

蛇咬毒害是一种易被忽视的热带病^[1]。对其发病率和死亡率的持续低估,使毒蛇咬伤成为世界卫生组织列出的所有“被忽视的热带病”之一^[2]。它被形象地描述为一种贫困疾病^[3,4]，因为它主要是在农村贫困人口中存在的问题，主要影响那些从事农业或渔业活动的人。不幸的是，这些被蛇咬伤的受害者通常是家庭中的劳动力，影响到了国家经济的发展^[5]。这种公共卫生问题在包括马来西亚在内的东南亚国家都存在，马来西亚是各种陆生动物和海蛇的栖息地，在马来西亚水域发生过海蛇咬伤的地方，海蛇蛇毒对于该水域的渔民是致命的危害^[6-8]。这也是21世纪全球范围内仍然存在的一个公共卫生问题^[4]。

马来西亚水域中有超过20种海蛇^[9]。虽然被海蛇咬伤致死的病例被报道得不多，但却并不少见^[8,10]。剑吻海蛇（Hydrophis schistosus），是该地区最常见的物种之一，分子系统发育学研究表明，这种胎生的海蛇现归属于青环海蛇属中^[11]。海蛇经常会被缠在渔网中，然后与其他捕获物一起被拖走，当渔民想将清除这些海蛇时，脚在甲板上或浑水中不慎踩到它们，就会被咬伤。与许多陆生毒蛇咬伤相比，被海蛇咬伤疼痛感相对较小，但是如果不能及时并且正确地进行治疗，就会迅速发生全身性中毒^[4,12-14]。据估计，海蛇咬伤致死率在3.2％到30％^[15]。在临床上，海蛇蛇毒的致死性极高。患者通常会发展成由呼吸衰竭引起的神经肌肉麻痹，和由横纹肌溶解症引起的肾脏并发症^{[13,14,16,17]}。较早的研究从剑吻海蛇中分离出了两种短神经毒素^[18]和一种肌肉毒素促磷脂酶A₂^[19]，它们是蛇毒中主要的致死性毒素。之后还有报道称剑吻海蛇蛇毒的蛋白酶具有碱性磷酸单酯酶、乙酰胆碱酯酶、5^，-核苷酸酶和透明质酸酶等酶活性。然而，剑吻海蛇蛇毒中这些酶的致病作用尚不清楚^[20]。迄今为止，唯一可用于治疗剑吻海蛇咬伤的抗蛇毒血清，是由澳大利亚联邦血清实验室制造的CSL海蛇抗蛇毒血清^[4]。然而，该产品在东南亚的价格非常昂贵（零售价接近2万令吉或5000美元每瓶），它需要严格的冷链运输和存储，在当地医院并没有被广泛使用，也没有足够的库存^[21]。然而，据报道，在小鼠致死毒性的研究中发现剑吻海蛇的蛇毒，能被其他轻毒的抗蛇毒蛋白如泰国眼镜蛇抗蛇毒蛋白交叉中和，猜测是由于蛇毒之间存在共同的抗原决定簇^[21-23]。剑吻海蛇蛇毒的详细分析和对单个毒素抗蛇毒中和的评估仍有待探索。

实际上，对蛇毒成分的全面了解对于阐明蛇毒（多种毒素的复杂混合物）的病理生理和免疫中和作用至关重要。由国际毒素学家社区通过全球蛇咬病倡议（GSI）提出的方法，旨在通过结合现代蛋白质组学、免疫学、药理学和分子生物学技术的综合策略，来改进对毒蛇咬伤的处理，以此来改进治疗方法，以及和对蛇毒的潜在的病理生理的理解^[2,24,25]。对蛇毒毒素进行细致的全面分析曾经是一项充满挑战且艰巨的任务。然而，蛋白质组学技术的最新进展使人们能够可靠地鉴定和定量测定蛇毒中的毒素蛋白，包括其中的微量成分。从那时起，我们对蛇毒蛋白质组学的认识有了显著提高，这为改进蛇咬伤的处理和药物的发现提供了新思路^[26-29]。迄今为止，医学上已经有了很多关于毒蛇蛋白质组的报道（例如^[30-36]），但是关于海蛇蛇毒的蛋白质组的研究却很少^[37,38]。在此项研究中，我们研究了马来西亚半岛西北沿海地区捕获的剑吻海蛇的蛋白质组，方法是依次分离蛇毒，然后通过高分辨率质谱分析来鉴定蛋白质。通过分析蛇毒的亚型和相对丰度，可以更深入地了解剑吻海蛇蛇毒的组成多样性。我们还假设，剑吻海蛇的主要致死毒素可以被异源泰国眼镜蛇抗蛇毒血清（泰国眼镜蛇单价抗蛇毒血清，NKMAV，和多价抗神经蛇毒血清，NPAV）交叉中和，在啮齿类模式动物体内进行检验，这为研究抗蛇毒血清对抗单一蛇毒的有效性提供了对比数据。

1. 材料和方法

1.1 蛇毒和抗蛇毒血清

蛇毒由CHT的其中一位作者从马来亚（槟州）半岛西北水域中的10条成年剑吻海蛇中提取所得。将蛇毒置于无菌的塑料容器内，随后将蛇毒样品冻干并收集。然后将蛇（由CHT鉴定）释放回海中。所使用的抗蛇毒血清是孟加拉眼镜蛇（N. kaouthia）单价抗蛇毒血清（NKMAV，冻干；批次NK00310；实验日期为2015年8月9日，从对泰国孟加拉眼镜蛇超免疫的马血清中获得的纯化的F（ab）2抗体）和多价抗蛇毒血清（NPAV，冻干；批次NP00109，实验日期：2014年10月5日；从对泰国孟加拉眼镜蛇、眼镜王蛇、马来环蛇和金环蛇的蛇毒超免疫的马血清中获得的纯化的F（ab）2抗体）。两种抗蛇毒血清均由泰国曼谷的萨瓦巴女王纪念学院（Queen Saovabha Memorial Institute）制造。

1.2 实验动物与道德伦理

本研究中使用的小鼠为白化病ICR株，4-5周的雄性，体重20-25g，由马来亚大学动物实验组提供。本研究中实验动物的使用规程基于CIOMS指南^[39]，动物的使用已得到马来亚大学机构动物护理和使用委员会的批准（参考：2014-09-11/ PHAR/R/TCH）。

1.3 实验材料

研究中使用的所有化学药品和试剂均为分析纯。碳酸氢铵，二硫苏糖醇（DTT）和碘乙酰胺购自Sigma-Aldrich（USA）。质谱测序级的胰蛋白酶，Spectratrade;多色广谱蛋白质梯（10-260kDa）和HPLC级溶剂购自Thermo Scientifictrade;Piercetrade;（USA）。HPLC柱（5mu;m）和MilliporeZipTipreg;C18移液器吸头均购自美国默克公司。

1.4 反相HPLC分离

将2mg初毒干粉溶于超纯水中，并以10,000g离心5分钟。 使用Shimadzu LC-20AD HPLC系统（日本）对上清液进行WP 300 C18反相色谱柱处理，以0.1 mL / min流速分离。流动相分别为0.1%TFA（三氟乙酸）和ACN（乙腈），蛇毒分离时的洗脱条件为：0-5%乙腈10 min，5-15%乙腈20 min，15-45%乙腈120 min，45-70%乙腈20min。蛇毒分离过程均在215nm检测波长下进行。手动收集各个检测峰并冻干。

1.5 SDS-PAGE和蛋白质胰蛋白酶消化

根据Laemml的方法^[40]，将通过反相HPLC获得的蛇毒冻干粉溶于超纯水中，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，15％分离胶，还原条件）。Spectratrade;多色广谱蛋白质梯（10至260 kDa）用于分子质量校准。将SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝染色，从胶上切下主要的蛋白质条带，并按照制造商（Thermo Scientifictrade; Piercetrade;, Rockford, IL, USA）的操作规程用DTT进行还原处理，用碘乙酰胺进行碱化处理，用MS级胰蛋白酶进行胶内酶解。 根据制造商的操作规程，使用Millipore C18移液器吸头（美国默克公司）将胰蛋白酶酶解得到的肽进行脱盐，以增强质谱仪的性能。

1.6 高分辨率HPLC串联质谱分析

胶内胰蛋白酶消化后，将所得的样品通过C18色谱柱（2mu;m，75mu;mtimes;25 cm）和超高压LC色谱柱（2mu;m，75mu;mtimes;25 cm）进行分离。肽段经过44分钟的分离，之后以300 nL/min的速度用0.1％甲酸水溶液（溶剂A）和含0.1％FA的100％ACN溶液（溶剂B）（0–5％溶剂B洗脱5分钟，5-50%溶剂B洗脱30分钟，50-95%溶剂B洗脱2分钟）。用95％溶剂B保持7分钟来完成运行。根据以下参数在Orbitrap Fusion质谱仪上使用全扫描方法采集得到MS1数据：扫描范围300–2000 m / z，orbitrap分辨率为240,000；AGC目标为200,000; 最长注射时间为50毫秒。根据以下参数采集得到MS2数据：快速扫描速率，CID碰撞能量30％，2 m / z隔离窗口，AGC 10,000，最大注入时间35 ms。选择MS2前体进行3s循环。询问指定的单同位素m/z和2-6电荷状态前体。使用70s动态排除窗口过滤前体。使用Thermo Scientifictrade;Piercetrade;Proteome Discoverertrade;软件（1.4版本）和SEQUESTreg;对从NCBI数据库下载的非冗余NCBI 蛇类数据库（8570条有效信息）（2014年8月更新）搜索MS/MS光谱。质谱质量偏差设置为10ppm和0.8Da，并允许多达两次错位断裂。设置Carbamidomethyl（C）为固定修饰。应用FDR为1％的高置信度过滤器，将具有最高蛋白质得分大于10的蛋白质视为可信鉴定。

1.7 蛋白质相对丰度

蛋白质相对丰度的估算参照以前病毒学研究中所述的方法（例如^[31,35]）进行。使用Shimadzu LCsolution 软件（日本）通过峰面积测量来估算蛇毒分离组分的相对丰度。SDS-PAGE分离出的蛋白条带的相对丰度可直接通过峰面积测量进行分析。同时使用Thermo Scientifictrade;Piercetrade;myImageAnalysistrade;软件（美国）通过光密度测定法来估算SDS-PAGE中各蛋白条带组分，然后根据蛋白质家族计算蛇毒蛋白组的相对丰度百分比。

1.8 致死毒性测定

基于蛋白质组学的发现，分离出的主要毒素（短神经毒素、长神经毒素，酸性磷脂酶A₂、碱性磷脂酶A₂）通过静脉或皮下注射到ICR菌株（20–25 g）的白化小鼠体内。对于短神经毒素，静脉或皮下注射剂量范围为0.05–0.2mu;g/g，对于长神经毒素，剂量范围为0.05–0.4mu;g/g，对于碱性和酸性磷脂酶A₂，剂量范围为0.05–1.2mu;g/g（n = 4每剂）。48小时后记录小鼠的存活率。使用概率分析确定毒素的半数致死剂量（LD₅₀）^[41]。

1.9 体内中和作用研究—挑战-救援中和

该方法改编自Tan等人^[21]：体内中和作用的研究是通过单独使用蛇毒和抗蛇毒血清进行的：将LD₅₀为2.5的蛇毒皮下注射到小鼠（20–25 g，n = 4）体内，10分钟后静脉注射适量稀释过的抗蛇毒血清（NKMAV或NPAV，总体积为200mu;L）。注射浓度梯度的抗蛇毒血清稀释液，在小鼠体内显示出从全部

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