OSNAP通过精细微调脱落酸的生物合成，和叶片衰老相关基因从而影响水稻ABA和叶衰的研究

原文作者 Chengzhen Lianga，Yiqin Wang，Yana Zhua，Jiuyou Tanga

摘要：长期以来人们就已知道，叶片过早衰老会降低水稻产量的稳定性，但推动这一关系的潜在分子机制很大程度上仍然未知。在这里，我们确定了主导叶片早衰的显性突变体（ps1-D）。PS1编码植物特有的NAC（无顶端分生组织，拟南芥ATAF1/ 2，和杯状形子叶）家族转录激活子，水稻NAC相似物，能被APETALA3/ pistillata激活（OSNAP）。OsNAP的超表达显著促进衰老，而抑制OsNAP的产生，衰老明显延迟，证实了该基因在水稻衰老的过程中的作用。 OsNAP的表达量与叶片衰老时期早晚密切相关。CHIP-PCR和酵母单杂交实验均表明，OsNAP正通过叶绿素降解和养分运输和相关的其他基因直接作用于叶片衰老基因，这表明OsNAP是指示水稻进程的理想标记。进一步分析确定OsNAP由脱落酸（ABA）特异性诱导，而在ABA生物合成突变体ABA1和ABA2中，则受抑制。此外，ABA含量在ps1-D突变中显著减少，暗示OsNAP对ABA生物合成的反馈抑制。我们的数据表明，OsNAP在ABA和叶片中充当的重要纽带。此外，在叶片衰老的延缓和籽粒充实时期降低OsNAP的表达，在两个独立的RNAi材料中能使产量增加6.3％和10.3％。因此，通过精确调控OsNAP的表述将是未来提高水稻产量的有效策略。

关键词：激素； 营养再活化； 细胞程序性死亡；

叶片衰老是植物的最后阶段的一个组成部分，由精细调控，复杂的调节网控制发育（1）。在衰老过程中，叶片细胞在细胞代谢，结构和基因表达上发生显著的变化。这些变化的最显著的特征是，叶绿体退化期间叶绿素的分解引起黄化，随后脂质，蛋白质和核酸等蛋白质水解，最终导致线粒体和核发生离解和细胞死亡（4,5）。此过程有利于水解和从根源到下沉组织之间营养物质的循环利用，提高繁殖成功率（6）。因此，衰老不是一个被动的过程，而是一个发育的编程的过程，有很强的适应优势（7，8）。虽然叶片衰老主要由发育年龄控制，其过程的开始和发育也是受到若干内因和外因的影响（1,9，10）。例如，脱落酸（ABA）被认为是一个促进叶片衰老的植物激素（11，12）。明确地说，内源脱落酸水平中控制脱落酸发出信号和急剧增加的调节基因，可以通过叶片衰老的植物得以观察。此外，外源应用的脱落酸已显示可以诱导加速叶片衰老的相关基因的表达，表明ABA信号转导和叶片衰老之间存在联系。此外，各种生物和非生物应力都能提升ABA水平和激活叶片衰老的信号传导通道。因此，目前ABA作为叶片衰老的关键正调节是非常清晰了，但是，ABA在叶片衰老中的调节作用的机械化证据是完全是基于RPK1和SAG113（11,15）的研究。因此，两者驱动ABA介导叶衰老和这个过程中ABA信号的特异性的分子机制仍未确定。NAC转录因子包括一个最大的植物特定的转录因子类以及参与各种植物的过程，包括植物生长发育，叶片衰老，细胞分裂，树木形成和生物/非生物的胁迫反应（16,18）。最近，这些转录物的高分辨率时间分析显示，NAC的117,30的基因的表达会在拟南芥自然衰老的各个时期发生明显的改变（12），这表明NAC转录因子在叶片衰老的调节中起着至关重要的作用。尽管有这个证据，但是，迄今只有少数的NAC转录因子可以特异性调节衰老。此前的研究已经确定了AtNAP(18)，Oresara1（19），Oresara sister1（20），Jungbrunnen1（21），VNI2在叶片衰老中发挥显著的调节作用（6），例如，AtNAP，ORE1，和ORS1的过度表达会引起早衰，阻断这些转录的功能因子能够显著延迟衰老，从而表明AtNAP，ORE1，和ORS1充当非冗余正调节拟南芥的衰老。相比之下，JUS1和VNI2对叶片衰老是负调节。虽然已经知道的水稻NAC基因有151个，迄今为止，只有少部分被证实在调节叶片衰老中起作用（22，23）。

叶片过早衰老是影响水稻（24）水稻产量稳定的主要因素之一，特别是杂交水稻。与典型的植物拟南芥相比，关键基因SAGs的鉴定和水稻中其同源分子的调节机制最近才刚刚开始。同样的，至今多数SAGs经鉴定只参与叶绿素的分解与降解，因为，有可能在复杂的机理中，基因的冗余的一个显著水平对衰老过程是不可或缺的，使用功能缺失突变体鉴别叶片衰老的关键调节被证明是困难的。为了揭示控制叶片衰老的关键基因，我们筛选功能获得型突变体的T-DNA群体。在这个过程中，超过250独立路线对改变衰老的表型进行了鉴定。一个能够显著表现叶片早衰的功能获得突变体PS1-D被选定为研究对象。

结果

PS1-D突变体表现出叶片早衰的表型。PS1-D突变体与发育四叶阶段之前的野生型植物相比不显示任何表型差异。然而当植物发展到分蘖期，叶衰老开始（图S1A），和在抽穗期PS1-D突变的所有五个上部叶（图S1 B和C）表现出显著加快叶片衰老。同样，在颗粒成熟后，PS1-D突变体具有一个加速变黄表型，显示比野生型植物早衰老7-10天。此外，开花后，相比野生型植物，PS1-D突变体也表现出叶绿素更快地降解。PS1-D突变体和野生型植物之间的最显著的区别是突变体和野生型植物在开花25天（DAF）后，突变体的叶绿素含量仅为的野生型植物三分之二。而且，这种叶绿素含量的差异随着时间的推移变得更加显著。例如，开花35天后，突变体的叶绿素含量只有野生型植物的20%，这表明，PS1-D突变体（图1B）的叶绿素比野生型植物降解更快速。同样地，4个叶绿素降解相关基因（CDGS），保持绿色（SGR）和红色叶绿素代谢产物还原酶1（RCCR1）（29，30），以及另外两个SAGs，Osh36和OSI57（31），在PS1-D突变体中，完全展开的叶片比野生型植物表达出更高水平（图1C）。总体而言，PS1-D突变体中叶片衰老过程显著加快。黑暗是对叶片衰老最强烈的外界刺激之一。因此，它经常用作模拟同步衰老的有效方法（5，25）。这表现在叶绿素含量迅速降低，两个衰老标记基因表达水平提高，突变植物中Osh36和OsI57（图S1 D-F），PS1-D突变体暗诱导显著加快叶片衰老（图1D）。总的来说，我们的结果清晰地表明，PS1的突变影响与衰老相关联的各种过程。

PS1编码植物特有的NAC转录因子。异源PS1-D后代的遗传分析表明，T-DNA插入在〜3：1的比例时，该叶片衰老表型分离，这表明PS1-D是T-DNA插入引起的一个显性突变。

通过SiteFinding PCR获得的T-DNA的侧翼区和序列分析表明，在T-DNA插入位点是在LOC_Os03g21060（图S2 A和B）的翻译起始位点214 bp的上游。在T-DNA邻近插入位点 的LOC_Os03g21060是PS1-D幼苗中基因表达升高20倍（图S2C）的唯一一个基因。在野生型植物中LOC_Os03g21060的过度表达导致了表型表现出不同程度的叶片早衰（图S2D）。同样地，这种衰老幅度变化与LOC_Os03g21060（图S2E）的表达水平相关。这些结果证实了两个LOC_Os03g21060都是PS1以及其激活是PS1-D突变体的过早衰老表型的原因。

PS1在N端含有一个典型的NAC结构（Fig.S2F）和AtNAP共享其区域约69％的氨基酸。它属于NAC蛋白的Va（1）/ NAP亚科，它在拟南芥中有三个成员，在水稻六个成员，并在玉米中有五名成员（图S3A）。此前PS1被评为（OsNAP），它可以补充AtNAP无效突变，证实了PS1是AtNAP的功能直向同源基因（18，22）。酵母的体外转录活性测定法确认OsNAP是一个功能性的转录激活剂（图S3B）。详细的区域分析表明，C末端区域（氨基酸181-392）具有较高的转录活化活性，而对NAC域的N-末端区（氨基酸1-190）显示没有任何活性。有趣的是，OsNAP的（氨基酸18-392）的C-末端区发现具有比全长基因更强的转录激活活性，这表明抑制结构域可能存在N-末端区域里。为进一步映射这些潜在的转录抑制域，在酵母系统截取OsNAP载体表达的各种长度进行了测试。 在这些片段当中，包含在NAC基序的子域3中的片段（氨基酸64-100）和4（氨基酸100-142）表现出强抑制活性，而子域1和2（氨基酸1-64）和5（氨基酸157-181）表现出弱抑制活性（图S3B）。这些结果表明，OsNAP用作转录激活。具体来说，OsNAP的C末端似乎充当激活域，而NAC子域3（氨基酸64-100）和4（氨基酸100-142）作为抑制剂用于协调C-末端活动。

OsNAP在衰老过程的组织中高度表达。时间和空间的表达分析表明，OsNAP优先地在叶片，叶鞘和胚乳被表达，在根，茎和幼穗（图S4A）的表达水平低，但仍然可检测的。因此，我们研究OsNAP在叶片不同发育阶段的表达。叶片越老，该OsNAP的转录越高，衰老的叶子比幼嫩，绿叶（图S4 B和D）高。同样地，旗叶的OsNAP表达的动力学分析表明，虽然开始之前OsNAP转录物的数量逐渐增加，在籽粒充实开始（图2A）急剧增加。通过一致的观察，在完全扩展的叶上OsNAP的表达从尖端到底部逐渐降低（图2B）。令人关注的是，在籽粒充实的过程中OsNAP在胚乳中的表达逐渐提高，在〜25 DAF达到其转录高峰（图S4C）。这一发现表明，OsNAP在胚乳成熟中起着重要作用，另一个细胞程序性死亡。总体而言，这些数据表明，OsNAP是在水稻自然衰老过程的理想标记。

转基因植物含有OsNAP的beta;葡萄糖醛酸酶（GUS）的构建体检查显示，OsNAP表达贯穿整个植物发育过程的一些不同的器官。例如，在幼苗中，在主根和侧根检测GUS活性，特别是在血管组织（图2C）。GUS也在茎秆和叶鞘（图2 D和E）的初生韧皮部特异表达。最后，用RT-PCR（QRT-PCR）定量的结果是一致的，GUS在老叶或在叶的衰老区域表达是最强的。组织切片的检查进一步表明OsNAP主要在韧皮部和在叶维管束的周边区（图2F），虽然GUS表达也在花组织（图2G）和胚乳（图2 H和I）能够观察到。在胚乳中，GUS表达与qRT-PCR建议的内源OsNAP表达模式定量一致，进一步证实了我们的假设，即OsNAP起到双向调节叶片衰老和胚乳成熟的作用。

ABA通过OsNAP表达参与叶片衰老调节。叶片衰老是一个基因控制的发育过程，可通过调节各种植物激素的和环境因素（1）。OsNAP的表达谱与来自不同的植物激素（包括油菜素类固醇，赤霉素，生长素，6-苄基氨基嘌呤，水杨酸，1-氨基环丙烷-1-羧酸，茉莉酮酸和ABA）衍生的RNA和非生物胁迫处理（冷，碱，甘露糖醇，和氯化钠）实施。结果表明，OsNAP只由ABA诱导，表达水平在ABA处理的2小时（图3A）之后增加了大约3倍。4小时后，OSNAP转录迅速高达16倍，6小时后增加了68倍，并且通过处理（图3B）12小时后变成102倍。相反地，OsNAP转录在两个ABA生物合成突变体ABA1和ABA2（图3C）明显降低，证实了我们的理论，OsNAP受到ABA调节。我们还研究CDGS和ABA处理后其他的SAGs的活跃的表达。观察ABA处理2小时后，在SGR和RCCR1表达没有增加，但4小时（图3D）后观察到略有增加。同样的，在ABA处理（图3E）后仅4小时观察到Osh36和OsI57的诱导表达。这种滞后表达意味着ABA介导叶衰老可能取决于OsNAP表达的调节，这反过来，无论是直接或间接都调节SAGs的表达。因此，OsNAP功能似乎是ABA信号转导和叶片衰老之间的重要纽带。

我们接下来检测了幼叶和PS1-D和野生型植物的完全展开叶中ABA的水平。在PS1-D突变体，ABA的含量显著比野生型植物（图3F）低。进一步检查发现的ABA生物合成关键基因，包括OsNCED1，OsNCED3，OsNCED4和OsZEP，在PS1-D突变体（图S5A）中转录水平显著下调，但ABA灭活没有检测到任何的变更基因，包括OsABA8X1，OsABA8ox2和OsABA8ox3（图S5B）。因此，看来在PS1-D突变体中的OsNAP高水平转录物可以进一步调节ABA生物合成通过反馈机制。

OsNAP功能SAGs的上游ABA诱导叶衰老。为进一步探讨OsNAP的内在功能，RNA干扰（RNAi）技术被用来抑制野生型植株OsNAP表达。RNAi构建专门针对OsNAP以外的非保守的3端NAC区域避免与其他NAC蛋白的干扰。表达分析显示在RNAi株系和野生型植物之间的五个直向同源基因没有显著改变（图S6A），确认OsNAP的RNAi靶向的特异性。我们的RNAi转基因株系显示明显延迟叶片衰老（图4A），这是在OsNAP表达（图4B）所观察到的下降是一致的。正如所料，典型的CDGS表达水平，包括SGR，NYC1，NYC3和RCCR1和其他SAGS，包括Osh36，OsI57，Osh69和OSI85，RNAi株系的完全展开叶的表达水平显著低于野生型植物（图S6 B和C）。

我们进一步研究离体叶片的衰老症状，在黑暗中用ABA处理培养10天之后，OsNAP的RNAi转基因植物离体叶片呈

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