低植酸大麦种子的磷和磷酸肌醇的表型分析

John A. Dorscha,Allen Cooka,Kevin A. Younga,Joseph M. Andersonb,

Andrew T. Baumanc,Carla J. Volkmannc,Pushpalatha P.N. Murthyc,Victor Raboya,*

摘要：肌醇-1,2,3,4,5,6-六磷酸 (植酸)通常占总磷含量的75%并有超过80%的可溶性肌醇磷酸盐存在于种子中。对四个非致命的种子磷和磷酸盐表型大麦(大麦属)低植酸突变进行了描述。在纯合的种子对M635和M955中植酸减少，分别是75%和超过90%，都伴随着减少其他磷酸盐和磷摩尔当量增加。这种表型暗示了磷基质的供应区。在大麦低植酸1-1(LPA1-1)的纯合种子中，植酸有45％的减少与之匹配的主要是磷的增加并伴随着少量P5的增加。在大麦LPA2-1的纯合子种子中，植酸的减少伴随着磷和一些植酸盐的增加，这表明磷酸盐代谢病变，而不是磷供应。大麦种子LPA2-1中增加的磷酸盐有Ins(1,2,3,4,6)P5;Ins(1,2,4,6)P4和它的对映异构体Ins(2,3,4,6)P4;Ins(1,2,3,4)P4和它的对映异构体Ins(1,2,3,6)P4;Ins(1,2,6)P3和它的对映异构体Ins(2,3,4)P3;Ins(1,5,6)P3和它的对映异构体Ins(3,4,5)P3(这里使用的方法不能区分对映异构体)。这主要是在高位观察玉米LPA2基因型的种子中，5-OH系列的磷酸盐与1-/3-OH系列是不同的，但以前的染色体映射数据表明，玉米和大麦LPA2位点可能直向同源于一个祖先基因。因此，这个假设或许可以解释不同LPA2的表型是他们共同祖先的多功能基因编码，磷酸激酶与1-/-3和5-激酶”的活动。假定的焦磷酸盐含有磷酸盐，可能是P7，也在除LPA2-1基因型的所有大麦成熟种子中观察到。大麦M955表明，至少在这个品种，积累P6的能力几乎可以废止同时至少能保持短期(1年)活力。

关键词：大麦;玉米;禾本科;大麦;玉米;种子表型;肌醇磷酸;低植酸

1. 介绍

在肌醇(Ins;1)的磷酸酯(2-20)和肌醇(1,2,3,4,5,6)P6(InsP6或植酸;17)之间是自然界最丰富的磷酸盐(Cosgrove,1980)。它通常占种子总磷含量的65%-85%(Raboy,1997)。Ins P6(17)普遍存在于真核生物中，它的代谢可能在真核细胞中有着许多作用(Shears,2001)。这些作用包括在成熟萌发的种子和其他植物组织、器官中的磷(P)、矿物质存储、体内稳态调节(Raboy,1997;Strother,1980);信使RNA输出和DNA双链断裂修复(Hanakahi and west,2002;York等,1999);作为磷酸盐和磷脂酰肌醇磷酸(PtdIns P)信号和发展的途径;作为抗氧化剂(Graf等,1987)。

Ins P₆(17)作为磷酸盐途径的一方面是它可以作为焦磷酸盐或含有”PP”磷酸盐衍生物合成的底物(Safrany等,1999)。PP磷酸盐衍生物有5-PP-Ins(1,3,4,6)P₄ (18),一种无植酸Ins P₆; 5-PP-Ins(1,2,3,4,6)P₅ (19), 一种Ins P₇ ; 5,6-bis-PP-Ins(1,2,3,4)P₄ (20), 一种Ins P₈。所有磷酸盐将使用“D-编号”对每个六碳环进行识别描述，如图1所示(Loewus and Murthy,2000)。一个给定的焦磷酸基团在Ins环上的位置在任何情况下都没有被确定，图1中给出的结构仅用于演示。

PP-磷酸盐可能在同源重组作用于信号传导/发育途径，或在一个ATP再生的新途径中担当磷酸供体(Luo等,2002; Safrany等,1999)。在植物细胞的PP-磷酸盐代谢研究中进展甚微，除了观察到在浮萍属(Spirodela polyrhiza L.)徒长枝形成的细胞中Ins和含磷化合物比Ins P₆更具极性L.(Flores and Smart,2000)，并在大麦(Hordeum vulgare L.)糊粉细胞中沿行吸取(Brealey and Hanke,1996)。 在种子生物学中，PP-磷酸盐作为ATP再生高能磷酸源的潜在作用特别有趣，因为它让人想起了几十年的老提案“植酸-磷酸肌醇系统充当ATP-ADP系统的缓冲区，在小麦(Triticum aestivum L.)胚乳发育过程中，保持ATP浓度在最佳合成期”(Morton and Raison, 1963)。

促进Ins P₆(17)在发育种子中的积累可被认为由两部分组成:Ins(1)的合成和随后的磷酸盐代谢。其基本结构途径可能在大多数真核细胞中相似。然而，特殊步骤或它们相对活性或生理重要性可能物种之间有所不同，而且大型遗传差异能分隔相对紧密相关的基因组。例如，Ins(1)的唯一合成源是葡萄糖-6-P到Ins(3)P₁(2)的转化，并由Ins(3)P₁合酶催化(MIPS; Loewus and Loewus,1980; Loewus and Murthy,2000)。有多达七个基因座在玉米(Zeamays L.)基因组包含MIPS的同源序列(Larson and Raboy,1999)，但只有一个在大麦(Hordeum vulgare L.; Larson and Raboy, 1999)和水稻(Oryza sativa L.; Yoshida等,1999; Larson等,2000)。

扰乱种子中Ins P₆(17)正常积累的突变在玉米中首次报道(Raboy and Gerbasi, 1996)，随后在大麦(Larson等, 1998; Rasmussen and Hatzack, 1998)，大米(Larson等, 2000)和大豆[Glycine max (L.) Merr.;Hitz等, 2002; Wilcox等, 2000]。这些低植酸或低肌醇六磷酸基因型结籽有总磷的正常水平，但大大降低了Ins P₆(17)的水平。前两个玉米低植酸基因型代表两类不同的表型(Raboy等,2000)。在低植酸玉米1-1种子中(LPA1-1或LPA1的第一隐性等位基因)，Ins P₆(17)的减少伴随着磷摩尔等价物的增加。在低植酸玉米2-1(LPA2-1)种子中，Ins P₆的减少6伴随着磷和磷酸盐有至多五个的磷酯增加。最丰富的磷酸盐除了玉米LPA2-1种子外是Ins(1,2,4,5,6)P₅(14)，一个rsquo;3-OHrsquo;五磷酸盐，和它rsquo;1-OHrsquo;的对映异构体，Ins(2,3,4,5,6)P₅(15)。用于确定结构中的方法没有区分对映体。据推测(Raboy等,2000)，早期对Ins P₆(17)，磷酸合成和供应的通路在LPA1-1种子中被扰乱，后来对于Ins P₆(17)，磷酸盐代谢的通路，在LPA2-1中被扰乱。有关于玉米LPA2的两种可能性：1)它是一个直接影响磷酸-1-/3-激酶活性的机能障碍； 2)它是一个在Ins P₆(17)代谢中某些远端步骤的机能障碍，间接导致Ins(1,2,4,5,6)P₅(14)或Ins(2,3,4,5,6)P₅(15)及其分解产物的积累。种子磷的分离和表征以及一组选定大麦LPA基因型的磷酸盐表型被描述，与其他先前报道的大麦低植酸基因型和表型类似玉米LPA的基因型相比较。

1. 结果

2.1.非突变大麦和玉米种子的磷和磷酸盐表型

定义大麦LPA基因型的种子磷和磷酸盐表型，并将它们与玉米LPA基因型比较，本研究中典型的大麦和玉米遗传背景的非突变种子磷和磷酸盐表型必须首先被描述。到一个种子磷和磷酸盐表型在这里采取的表征方法包括四个步骤：(1)种子磷和总磷酸盐的定量分析; (2)高效液相色谱法(HPLC)测定表型;(3)10倍的高效液相色谱(HPLC)分析;(4)核磁共振分析(NMR)作为游离酸获得部分纯化的种子磷酸盐。大麦LPA基因型研究分离后的品种“哈灵顿”的化学诱变。定量分析非突变粮食生产品种(表1)，该品种在一个苗圃并排生长的LPA突变体详情如下，它含有4.77毫克总磷/g，其61％(2.89mg/g)是总磷酸盐(磷酸盐总和通过铁沉淀，包括Ins P₆,17)和8%(0.4mg/g)磷。

高效液相色谱法表型分析(Phenotyping-HPLC)是为基因型提供最直接和可再生的表型比较方法(图2;表2)。提取种子样品并按照相同的过滤和稀释步骤，并立即用HPLC测定样品。提取和分析之间没有额外的中间步骤，其中每个都将添加测量误差。哈氏种子提取物(图2A，表2)的高效液相色谱法表型分析证实，由该非突变大麦生产谷物，总磷酸盐，如由铁植酸沉淀法测定，主要由Ins P₆(17)组成与其它磷酸盐占总磷酸盐的16%。可溶性磷酸盐除了Ins P₆(17)似乎主要是由四个五磷酸盐，和一个或多个低水平四磷酸盐。与色谱标准的比较表明，五磷酸盐是最短到最长的相对保留时间：Ins(1,2,3,4,6)P₅(11);Ins(1,2,3,4,5)P₅(12) 和Ins(1,2,3,5,6)P₅(13)(这里使用的高效液相色谱法(HPLC)和核磁共振法(NMR)不区分对映体);Ins(1,2,4,5,6)P₅(14)和Ins(2,3,4,5,6)P₅(15); Ins(1,3,4,5,6)P₅(16)。

接下来使用的10倍的高效液相色谱(HPLC)分析比表现型鉴定更敏感(图3)。对于10X-HPLC，首先提取种子和提取物过滤，检测前将磷酸盐通过铁降水集中。这种方法(图3A)中，除了五磷酸盐外(11,12和/或13,14和/或15,和16)和Ins P₆(17)，低含量的至少两个四磷酸盐，和低水平的含磷化合物的比Ins P₆更具极性(未知1,图3A)，假定的含焦磷酸盐Ins P₇或Ins P₈(如19或20)，在非突变的种子萃取物可再现观察。

磷酸盐核磁共振分析(图4)，由非突变大麦种子中提取浓缩，半纯化游离酸中确认存在Ins(1,2,3,4,6)P₅(11), Ins(1,2,3,4,5)P₅(12)和对映异构体Ins(1,2,3,5,6)P₅(13)和两个四磷酸盐。Ins P₄存在显示在delta;3.66(三重峰，J = 9.2Hz赫兹)和delta;3.8(双重双峰，J = 9.5和2.2Hz，图4)这两个相对高磁场共振。其他氢的化学转换，图4所示，分别与成对磷酸盐的存在一致。J-分辨和GDPCOSY光谱与 Ins(1,2,4,6)P₄(7) 和/或它的对映异构体Ins(2,3,4,6)P₄(8)的存在相一致。delta;3.5(三重峰，J = 9.2Hz赫兹)和delta;3.78(三重峰，J = 9.5和2.2Hz)这两个相对高磁场共振和J分辨光谱表明Ins (1,2,3,4)P₄(9) 和/或它的对映异构体Ins(1,2,3,6)P₄(10)的存在。再次，GDPCOSY光谱与结构分配相一致。

在这些研究中，非突变的玉米自交是A619。对非突变体A619产生的成熟种子进行表型高效液相色谱法测定(图2F，表2)表明，Ins P₆(17)占种子总磷酸盐含量的96%。该测定也检测到两个五磷酸盐:Ins(1,2,4,5,6)P₅(14)和/或它的对映异构体Ins(2,3,4,5,6)P₅(15);Ins(1,2,3,4,5)P₅(12) 和/或它的对映异构体Ins(1,2,3,5,6)P₅(13)。A619种子纯化磷酸盐混合物的核磁共振分析表明，Ins P₆(17)是最丰富的磷酸盐样品(图5)。此外，检测到三个五磷酸盐。一项共振，三重(J = 9.3Hz赫兹)相对高磁场(约3.66)，表明在该化合物H-5的孪位为羟基基团。该化合物连接了其他两个共振(H-2的连接不明显)，表示该化合物是对称的，并提供Ins(1,2,3,4,6)P₅(11)存在的附加确认。在另一个自旋系统的共振之一，双重双峰(J = 10.6和2.5赫兹)相对高磁场(约3.84)，表明H-3(或H-1)的孪位为羟基基团。其它共振，以及GDPCOSY光谱实验的结果，同样也与Ins(1,2,4,5,6)P₅(14)和/或它的对映异构体Ins(2,3,4,5,6)P₅(15)的存在相一致。最后，第三个自旋系统在图5包含一个三重体(J = 9.7Hz赫兹)相对高磁场

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