鉴定一个参与甘露聚糖生物合成的额外蛋白

作者：Yan Wang^1,2, Jennifer C. Mortimer³, Jonathan Davis^2,4,dagger;, Paul Dupree³ and Kenneth Keegstra^1,2,4,5,*

单位：¹Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA,

²Department of Energy Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA,

³Department of Biochemistry, University of Cambridge, Cambridge, CB2 1QW, UK,

⁴Department of Plant Biology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA, and

⁵Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA

摘要：半乳甘露聚糖由a-1，6-半乳糖基残基取代的b-1，4-甘露聚糖骨架组成。编码主要负责合成半乳甘露聚糖骨架和侧链加成酶的基因先前被鉴定和鉴定。为了鉴定与半乳甘露聚糖生物合成有关的其他基因，我们先前对胡卢巴种子胚乳进行了深入的EST分析，在种子发育过程中积累了大量的半乳甘露聚糖作为储备碳水化合物。

其中一个候选基因编码一个可能是糖基转移酶的蛋白质。由于该蛋白参与甘露聚糖的生物合成，我们将其命名为“甘露聚糖合成相关”（MSR）。在此，我们报道了一个长春花MSR基因（TfMSR）及其两个拟南芥同源物AtMSR1和AtMSR2的特征。

TfMSR在胚乳中高度特异表达。荧光共聚焦显微镜检测TfMSR、AtMSR1和AtMSR2蛋白均定位于高尔基体。拟南芥msr1单T-DNA插入突变体茎匍甘露聚糖中甘露糖残基水平下降约40%，msr1 msr2双突变体下降超过50 %，而msr2单突变体则保持不变。

此外，来自msr1单突变体和msr1 msr2双突变体茎的体外甘露聚糖合成酶活性也降低。在msr1 msr2双突变体中表达AtMSR1或AtMSR2完全或部分恢复甘露糖基水平。从这些结果可以看出，MSR蛋白对甘露聚糖生物合成具有重要意义，并对其作用提供了一些思路。

关键词：甘露聚糖生物合成；高尔基蛋白；糖基转移酶；GT65；拟南芥

1引言

甘露聚糖是植物中广泛存在的半纤维素多糖。根据主链的组成和侧链的存在/缺失，甘露聚糖多糖可分为四种类型：甘露聚糖，葡聚糖，半乳甘露糖和半乳葡甘露聚糖。甘露糖和甘露糖都包含一个线性的b-1,4链，前者由甘露糖残基组成，后者由甘露糖和糖基残基组成。甘露聚糖或葡甘露聚糖的主干可以被-1,6连接的半乳糖体取代，从而产生半乳甘露聚糖或半乳葡甘露聚糖（Reid，1985）。葡萄糖纤维素是裸子植物次生壁中的主要半纤维素（Fengel and Wegener, 1989）。虽然甘露聚糖多糖在大多数被子植物中通常含量较低，但它们会大量沉积在选定植物的某些特殊组织中。例如，半乳糖作为储备多糖大量储存，特别储存在许多豆科植物的种子胚乳中，包括瓜尔语（四甘菊）和胡芦巴（三角草）（Reid, 1985）。葡萄糖也作为一种储备多糖储存在巫毒百合的块茎中（Gilleetal., 2011）。

半乳糖甘露聚糖广泛应用于食品、纺织、造纸、制药、化妆品、石油、钻井和炸药等行业（Srivastava and KaPoor, 2005）。此外，半乳甘露聚糖是由酵母发酵的己糖组成的整体，容易被消化。这些特性使它们成为一种理想的聚合物，可以为植物生物量生产生物燃料提供糖（Pauly and Keegstra, 2008 ）。了解半乳甘露聚糖的生物合成及其调控，最终可能为此类实际应用增加植物中半乳甘露聚糖的水平。

在过去几年里，人们对甘露聚糖的生物合成有了很多了解，其中一部分是通过开发快速沉积大量半乳甘露聚糖的系统（Edwards et al., 1999; Dhugga et al., 2004）。甘露聚糖在高尔基体内通过至少两种酶的作用合成：甘露聚糖合成酶（ManS）用于骨架合成，半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶（GMGT）用于侧链加成。前人以豆科植物种子为模型系统，对瓜尔豆（Dhugga et al., 2004）中纤维素合成酶样A（CSLA）基因编码的甘露聚糖合成酶进行了鉴定和鉴定，并对葫芦巴（(Edwards et al., 1999）中编码半乳甘露聚糖的半乳糖基转移酶基因进行了鉴定和鉴定。CSLA基因在许多陆地植物中被发现（ Yin et al .，2009 ）。多种物种异源表达的CSLA蛋白在体外显示甘露聚糖或葡甘露聚糖合成酶活性（Dhugga et al., 2004; Liepman et al., 2005; Suzuki et al., 2006; Liepman et al., 2007; Gille et al., 2011; Wang et al., 2012）。分析拟南芥CSLA突变体和过表达植株进一步证实CSLA蛋白在体内具有葡甘聚糖合成酶（Goubet et al., 2009）的功能。尽管在确定和表征半乳糖葡萄糖甘露聚糖生物合成的酶方面取得了这一进展，但很可能需要其他重要的酶，需要更好地了解这一过程的许多方面。例如，对于引发聚合物合成的机理或确定聚合物长度的方法，人们一无所知。动物和微生物中的多糖合成通常是通过形成引物分子，将糖转移到蛋白质、脂类甚至另一种多糖上来启动的（Carlsson and Kjellen, 2012; Hartley and Imperiali, 2012; Roach et al., 2012）。植物细胞启动细胞壁多糖合成所需引物尚未鉴定。

为了更好地理解半乳甘露聚糖生物合成的整个过程，并开始识别控制该过程的转录调控网络的组分，本研究对长春花种子胚乳进行了深度EST分析(Wang et al., 2012)。在这个体系中，大量的半乳甘露聚糖积累在相对较短的时间框架内，由进入发育种子的蔗糖( Wang et al., 2012)形成。利用EST图谱分析，除了已知的ManS和半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶基因外，还鉴定了可能参与半乳甘露聚糖生物合成的基因。第二个高表达基因，在上一份报告(Wang et al., 2012)中称为TfDUF246，但在这里命名为TfMSR (与甘露聚糖合成有关)；Genbank登录号JX237834 )，编码一个可能参与甘露聚糖生物合成的蛋白。在此，我们利用分子、细胞、遗传和生物化学方法对TfMSR及其两个拟南芥同源基因AtMSR1和AtMSR2进行了鉴定。这些结果支持我们的假设，即这些蛋白参与了甘露聚糖的生物合成。

2结果

TfMSR特异性表达于葫芦巴种子胚乳

TfMSR全长cDNA序列由约33 000条EST序列拼接而成，全长1454nt，开放阅读框1239nt。推导的蛋白序列长413个氨基酸，预测分子量为46.4 k Da，等电点为7.89。由于TfMSR在大量半乳甘露聚糖特异积累的长春花种子胚乳中高表达，我们推测TfMSR可能参与半乳甘露聚糖的生物合成。如果是，那么TfMSR的表达应该局限于胚乳。利用从各家系组织中分离到的RNA进行RT-PCR分析的确显示了TfMSR在胚乳中的特异性表达，对于家系ManS ( TfManS )基因( Genbank登记号 JX237835 )是如此(图1 )。这两个基因都是胚乳中表达量最高的10个基因之一(Wang et al., 2012)。

拟南芥同源物的鉴定

由于目前还没有建立一种用于葫芦巴转化的方法，而且遗传工具也不具备，因此对辣椒MSR功能进行分子遗传分析是非常困难的。因此，我们寻求鉴定拟南芥同源物，以便利用拟南芥分子遗传学的力量对该基因进行功能表征。以TfMSR推导的氨基酸序列作为查询，利用BLASTP搜索拟南芥蛋白数据库( http://www.arabidopsis.org/)。本分析得到两个同源物At3g21190和At1g51630，分别称为AtMSR1和AtMSR2。TfMSR对AtMSR1和AtMSR2分别显示47 %和45 %的序列一致性，以及67 %和65 %的序列相似性，AtMSR1对AtMSR2分别显示83 %的序列一致性和91 %的序列相似性(图S1 )。这三种蛋白也具有相似的大小( 413、422和423个氨基酸)，预测在N端有一个跨膜结构域，在C端有一个大的保守结构域(图S1 )。由于AtMSR1和AtMSR2是TfMSR的同源物，我们推测它们也可能参与甘露聚糖的生物合成。

图1 胡芦巴MSR ( TfMSR )的RT-PCR分析。以TfManS为参照，葫芦巴伸长因子1a ( TfEF-1-a )为对照。第1泳道和第2泳道，花后25天和32天胚乳；第3和第4泳道，花后25天和32天的幼胚；第5和第6泳道，幼穗叶片。

TfMSR、AtMSR1和AtMSR2定位于高尔基体

如果MSR蛋白直接参与甘露聚糖生物合成，则应定位于甘露聚糖及其他基质多糖合成的高尔基体。利用蛋白质组学技术，Dunkley等人( 2004,2006年)和Parsons等人( 2012)先前报告，AtMSR1和AtMSR2定位于高尔基体。为了检测TfMSR的定位并确认其两个拟南芥同源物的定位，将每个蛋白的一个GFP标签版本与一个高尔基标记( ST-mRFP ) (Renna et al., 2005 )在烟草叶片中瞬时表达，利用活细胞共聚焦显微镜进行定位检测。与预期一样，GFP标记的MSR蛋白与高尔基体标记ST-mRFP在点状结构中共同定位(图2 )，表明它们在高尔基体中定位。在一些ST-mRFP信号不存在或与GFP信号不完全重叠的点状结构中也发现了GFP标记的MSR蛋白。在对AtCSLA9和AtCSLC4 (Davis et al., 2010)的定位研究中，也发现了类似的信号不完全重叠的模式，并可能指示其定位到高尔基体外的跨高尔基体网络或分泌结构。

图2 . GFP标记的MSR ( GFP-MSR )蛋白的细胞定位。( a ) Gfp-Tfmsr；( D ) Gfp - Atmsr1；( G ) Gfp - Atmsr2；( b , e , h ) St-Mrfp；( c , f , i )融合图像。箭头表示ST-mRFP信号不存在或与GFP-MSR信号不完全重叠的点状结构。比例尺= 5mu;m。

Atmsr1和Atmsr2的表达

我们首先用RT-PCR方法检测了野生型Col-0植物不同组织中AtMSR1和AtMSR2的表达(图3)。这两个基因在所检测的所有组织中均有表达，并且在幼苗的根、花、角果和茎中都有较高的转录水平，特别是茎的顶端区域(图3）。

为了进一步研究这两个基因在组织中的特异性表达，我们构建了含有AtMSRpro：GUS转录融合蛋白的稳定转基因株系。转基因株系全苗或各组织的GUS染色显示，AtMSR1和AtMSR2的表达模式存在重叠，也存在差异或互补（图4）。对于AtMSR1，除基部外，在根的维管组织中都有较强的GUS染色，而对于AtMSR2，在根的维管组织和表皮以及幼嫩侧根尖部都有较强的GUS染色，而在4日龄幼苗的初生根基部半部或上半部与侧根尖部之间的区域没有。AtMSR1在子叶的保卫细胞以及幼叶的毛状体、脉(维管组织)和保卫细胞中也高表达，而AtMSR2在毛状体基部周围的细胞环(称为套细胞或辅助细胞)中高表达。两个基因在幼叶近半叶中的表达量均高于远半叶。

这两个基因在成熟植株的花、角果和茎中也高表达，在较年轻的器官中表达量较高。AtMSR1在花的叶柄和花瓣以及AtMSR2在花的叶柄和雌蕊中均有较强的GUS染色。在茎中，这两个基因在韧皮部中强表达，在木质部和表皮中弱表达。在茎中部区域，囊间纤维细胞中也有较强的AtMSR1表

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