海藻糖代谢调节葡萄糖稳态使果蝇发育健壮和稳定

原文作者：Ryota Matsushita^1,2， Takashi Nishimura^1,2

单位：¹Laboratory for Growth Control Signaling, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research (BDR), 2-2-3 Minatojima-Minamimachi, Chuo-ku, Kobe, Hyogo 650-0047, Japan. ²Graduate School of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 8916-5 Takayama, Ikoma, Nara 630-0101, Japan.

摘要：生物体已进化出分子机制，以确保在面对环境波动时保持一致和不变的表型。发育稳态由两个因素决定：健壮性，缓冲环境变化；发展的稳定性，它可以缓冲内在的随机变化。然而，我们对这些噪音缓冲机制的理解还不完全。在这里，我们发现适当的血糖控制可以使果蝇的发育稳态。我们发现海藻糖代谢可以缓冲循环中的葡萄糖水平，海藻糖代谢在循环中起着葡萄糖库的作用。此外，海藻糖合成酶（Tps1）的突变增加了个体间和个体内翅膀大小的差异。野生型果蝇对饮食中的碳水化合物和蛋白质水平的变化有很大的抵抗力，而Tps1突变体在应对饮食压力时，发育稳态产生了显著的紊乱。这些结果表明，对抗饮食压力的葡萄糖稳态对发育稳态至关重要。

关键词：海藻糖代谢；葡萄糖；稳态；健壮性；稳定性

生物体剧烈和长期暴露在各种环境条件下，这些环境条件包括温度、湿度、辐射和营养等。尽管有这些干扰，许多生物可以发展出相对一致的表现型，因为它们对环境变化具有内在的健壮性。发育稳态的概念是指有机体在应对遗传和环境变化时保持表型一致性和可再生结果的能力^[1]。

发育过程中的表型变异由两个关键因素决定：健壮性（包括同义术语，如渠化）和发育稳定性。发育的健壮性，或微环境渠化，缓冲表型变化应对遗传和/或环境条件^[2]。发育稳定性缓冲对抗局部的和小的，随机的紊乱，称为发育噪声^[3,4]。发育健壮性通常被评价为具有相同遗传和环境条件的个体之间的表型变异。相比之下，发展性稳定程度的评估采用波动不对称（FA），它是对完全对称的随机偏差的度量。某一特定性状的个体间较低的变异（IIV）反映了其稳健性，而FA的降低反映了一个生物体缓冲发育过程中产生的随机噪声的能力。尽管FA的遗传力通常很低，表明FA没有或很少有加性遗传基础，但发育稳定性的提高与适应性的提高有关^[5,6]。

以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的翅膀为模型系统，对其发育稳态的遗传基础进行了深入研究^[7,8]。健壮性和发育稳定性都被认为是多基因性状，它们的变异主要由许多影响小的基因决定，而不是由少数影响大的基因决定^[9,10]。在果蝇中，表型变异可以在人工控制的营养条件下生长的基因典型相同的个体中进行评估。然而，即使在受控条件下，双侧对称结构的表型变异也会发生，无论是在个体之间还是个体内部。个体内部变异（例如，FA）的原因被认为与发育噪声的随机性质有关，因为左右结构是在相同的外部和内部环境条件下产生的，使用相同的基因型。

健壮的体型和对称需要高度连接的遗传网络，这个遗传网络在发育过程中稳定细胞生长和增殖的精确性^[7,8]。发育器官的生长受营养敏感的系统信号和局部信号（如形态梯度）调控。因此，代谢稳态进行适当的控制对应对饮食波动的胚胎后发育至关重要。代谢稳态是由高度调节和复杂的反馈系统来维持的，这些反馈系统确保了食物摄入、能量消耗和资源储存之间的微妙平衡^[13,14]。这种进化保守的胰岛素样肽是主要的营养敏感合成代谢激素，它可以促进餐后血糖被多个器官吸收并调节组织生长^[15,16]。在果蝇幼虫发育过程中，需氧糖酵解对身体生长是必不可少的，这表明血糖控制是维持发育完整性的核心组成部分，为每个器官提供持续的能量供应。

在果蝇体内，主要的血淋巴糖是海藻糖二糖，它在血液循环中起着葡萄糖库的作用^[19,20]。海藻糖是由脂肪体内的海藻糖-6-磷酸合酶1（Tps1）合成的，脂肪体是果蝇的一个类似于哺乳动物肝脏的器官。海藻糖代谢不足将导致幼虫发育迟缓和生长缺陷^[21]。此外，据报道，高糖或高脂肪饮食诱导的肥胖幼虫会出现代谢综合征，如处于循环中的葡萄糖水平升高，脂肪含量增加和胰岛素抵抗，并表现出严重的生长迟缓^[22,23]。因此，除了营养敏感的系统信号网络，体内血糖稳态控制对发展中的平均身体生长也至关重要。尽管血糖控制对代谢稳态的具有重要，但控制血糖稳态和发育稳态之间相互作用的机制仍不清楚。

在这里，我们报道海藻糖代谢作为一种代谢缓冲，以维持果蝇的健壮发育。我们发现Tps1突变体表现出与进食相关的高血糖和空腹低血糖，从而表现出对代谢紊乱的脆弱性。我们进一步发现，Tps1突变体成体翅膀的IIV和FA增加。值得注意的是，Tps1突变体的FA缺陷在低葡萄糖（LG）饲养下急剧恶化，然而高葡萄糖（HG）饲养会减弱突变体的表型。然而，HG和低蛋白饲养均使Tps1突变体的IIV水平下降，表明环境变化对Tps1突变体的发育健壮性和稳定性有不同程度的影响。总之，目前的研究提供了葡萄糖稳态影响发育稳态的直接证据。海藻糖代谢可能进化为通过缓冲葡萄糖波动来应对环境变化来使发育稳态最大化。

结果

海藻糖代谢在葡萄糖稳态中的作用。为了理解葡萄糖稳态对发育稳态的重要性，我们利用了反向遗传学，这有助于直接控制循环中的糖水平（图1a）。为此，我们利用了一个名为Tps1MI03087的Tps1次等位因素对偶基因，因为Tps1的无意义暗码突变会导致蛹期的完全致死^[21]。在Tps1的第一个内含子中插入一个Minos转座子，刚好在翻译起始密码子之前（图1b），这将使mRNA的表达水平降低到野生型三龄中期幼虫水平的20%左右^[21]。我们将Tps1MI03087系与一个控制应变w-回交称为Tps1^MIC。代谢分析显示，纯合子Tps1^MIC突变体在取食后游离阶段海藻糖水平降低到对照的20%（图1c）。葡萄糖，糖原，甘油三酯（TAG）水平在整个幼虫水平上没有变化。

为应对饮食挑战，血液淋巴中的葡萄糖水平比海藻糖水平波动更剧烈^[24,25]。为研究海藻糖代谢在摄食期葡萄糖稳态中的生理作用，我们决定利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定三龄幼虫体内循环糖的绝对浓度。我们发现，当喂食含10%葡萄糖的正常饲料（ND）时，Tps1突变体的葡萄糖水平高于对照组幼虫（图1d）。Tps1突变体中增加的葡萄糖水平可以通过长期饲喂无葡萄糖饲料（LG饲料）来逆转。相比之下，含20%葡萄糖的HG饲料进一步提高了对照组和Tps1突变体幼虫的葡萄糖水平，表明循环中的葡萄糖水平反映了饮食中的葡萄糖水平。Tps1突变体还显示多醇途径代谢产物山梨醇和果糖水平升高（图1a），其水平与葡萄糖水平基本一致。与葡萄糖和果糖相比，饮食依赖性海藻糖水平的变化并不那么明显。

为了进一步研究由急性攻击导致的变化，我们将生长在ND环境下的三龄幼虫转移到纯水饲料中饲养4小时。急性剥夺饲料降低了对照组幼虫的循环葡萄糖水平，但没有降低海藻糖水平（图1d）。有趣的是，Tps1^MIC突变体的血糖水平低于对照组幼虫，表明Tps1突变体经历餐后高血糖和空腹低血糖。此外，急性高糖胁迫（从LG到20%葡萄糖饲料4 h）使Tps1突变体幼虫的葡萄糖和果糖水平比对照组显著升高。由于海藻糖是血淋巴中的主要糖分，其浓度是葡萄糖的100倍以上（图1d）^[25,26]，我们认为海藻糖代谢可以缓冲循环中葡萄糖水平的波动，以应对急性或慢性饮食挑战，在葡萄糖稳态中发挥关键作用。

图1 海藻糖代谢在葡萄糖稳态中的作用。a 海藻糖和葡萄糖代谢概述。在海藻糖代谢中起作用的蛋白质用红色表示。b Tps1基因座的示意图。蛋白质编码区和非编码区分别由黑盒和白盒表示。Minos的插入位置用倒三角标记。c Tps1^MIC突变体的海藻糖、葡萄糖、糖原含量和TAG数量变化情况。d 不同饮食条件下的循环糖水平。ND，正常饮食；LG，低糖饮食；HG，高糖饮食；Glc，葡萄糖。饲料的组成如图5a所示。*plt; 0.05，**plt; 0.01，***plt; 0.001；未配对双因素t-检验（c），未配对双因素t-检验加Bonferroni校正（d）。结果以均数plusmn;SD表示。数量为代表生物的数量。

海藻糖分解代谢使细胞自主地调节器官生长。接下来，我们研究了海藻糖代谢受损对器官生长的影响。尽管潜在的机制仍有待澄清，但在Tps1^MIC突变体中观察到性别二态性的存活率：大约30%的雄性和70%的雌性在营养良好的ND条件下闭合^[21]。在雄性和雌性果蝇中，封闭突变体果蝇的整体形态与对照果蝇的形态没有明显区别（图2a）。详细分析显示，无论雄性还是雌性，Tps1^MIC突变体的翅膀面积都比杂合子果蝇小（图2b），表明海藻糖水平的长期降低会减小器官尺寸。

器官大小的变化是由细胞大小和/或细胞数量的变化引起的。为了确定在Tps1^MIC突变体中观察到的翅膀尺寸的减少是否是由细胞数量、细胞大小或两者都造成的，我们测定了翅膀毛密度。成虫的翅膀由两层上皮组成。因为翅膀上的每个细胞产生一根毛发，毛发密度与细胞大小成反比。无论是雄性还是雌性，Tps1突变体的毛发密度都比杂合子果蝇增加，而计算出的细胞数量没有变化（图2b）。因此，Tps1^MIC突变翅膀小是因为它们包含更小的细胞，细胞数量的变化最小。

接下来，我们使用组织特异性遗传操作，对海藻糖分解代谢对器官生长的细胞自主贡献进行了研究。海藻糖水解酶 trehalase （Treh） 的基因位点通过选择性剪接产生两种定位不同的蛋白：膜结合型海藻糖酶（cTreh）和分泌型海藻糖酶（sTreh）（图1a）。cTreh和sTreh在发育过程中在各种组织中表达，是功能冗余的^[21,27]。使用en-Gal4将Treh敲落在翼状椎间盘后室，并未影响成虫的整体翅膀形态（图2c）。然而，Treh敲除后，后区面积与前区相比显著减小（图2d）。相比之下，cTreh的过表达，而sTreh的正常表达，增加了后区尺寸。翼盘中Tps1的敲除对翼的大小没有影响，因为Tps1仅在脂肪体中表达^[21]，因此，作为一个额外的阴性对照。这些结果表明海藻糖水解以细胞自主的方式影响器官生长。

除了海藻糖，支链多糖糖原的功能作为一种形式的细胞内葡萄糖储存。糖原代谢不足的幼虫表现为各种代谢改变和生长缺陷^[28]。然而，糖原合成酶（GlyS）和糖原磷酸化酶（GlyP）基因敲除成虫的翅膀形态和大小与对照成虫无明显差异（图2c，d），说明在正常生长条件下，糖原代谢对于翅膀的发育和形态发生是不可缺少的。

图2 海藻糖分解代谢使细胞自主地调节器官生长。a Tps1^MIC突变体成虫形态正常。b相对于杂合突变体的翅膀大小、细胞大小和细胞数量的折叠变化。c 成虫翅膀的代表性图像。en-Gal4被用于驱动翅膀后部的UAS转基因。红线表示后室和前室的界限。测量蓝色的包围区域以获得翅膀的大小。d 成体翅膀后/前间隔区之间的大小比率（P/A）。折叠变化显示相对于对照（en-Gal4gt; mCherry-RNAi）。*plt; 0.05，**plt; 0.01，***plt;

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